1951年2月8日，美國約翰霍普金斯大學(xué)George Gey通過宮頸癌活細胞檢查分離出一些細胞，并將它們放在具有某種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。這株細胞（來源于名為Henrietta Lacks的患者）不同于Gey和同事所試驗過的其他細胞，非常完美地適應(yīng)了新環(huán)境。八個月后，Lacks死于癌癥，但是她的細胞（被稱為HeLa細胞）成為了首個無限增殖細胞系，具有在人工培養(yǎng)情況下無限增殖的能力。在完成分離后的幾十年間，科學(xué)家們已經(jīng)培養(yǎng)出大約20噸的HeLa細胞。

同時，研究人員已經(jīng)找到眾多的方式，能將來源于人類和動物的原初組織轉(zhuǎn)化為無限增殖細胞系。如今，實驗室供應(yīng)商和非盈利性的存儲庫中擁有成百上千的細胞系，專門適用于完成從產(chǎn)生蛋白到病毒培養(yǎng)的任何工作。雖然胚胎干細胞和誘導(dǎo)性多功能干細胞可能得到更多的媒體關(guān)注，但是普通的體細胞系仍然形成了生物醫(yī)學(xué)研究的支柱。

細胞系的選擇已經(jīng)擴展到了廣泛的物種中。位于弗吉尼亞州馬納薩斯美國模式培養(yǎng)物研究所（ATCC）的細胞生物學(xué)組首席科學(xué)家和負責(zé)人Fang Tian說，“在（我們）常規(guī)種類中，我們實際上已經(jīng)具有超過60個種類，并且有一些是來源于國外的。”ATCC目前保存有超過3000個細胞系。位于新澤西州卡姆登的卡瑞爾醫(yī)學(xué)研究所也維護著幾千種，他們重點關(guān)注的是代表特定疾病的人類株系。

比例的問題

即使成千上萬的細胞系僅需要點點鼠標或打個電話就能獲得，但科學(xué)家們還是覺得選擇不夠充分。這正是加州大學(xué)舊金山分校醫(yī)學(xué)院博士后學(xué)者Mark Stenglein在研究蛇體中包涵體病（IBD）時所面臨的情況。

該項目最初是因為一個毒蛇愛好者找到了Stenglein的導(dǎo)師Joseph DeRisi，DeRisi是霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所（HHMI）的研究員，也是加州大學(xué)舊金山分校的生物化學(xué)與生物物理學(xué)教授。蛇愛好者解釋道，包涵體病能夠引發(fā)行為改變，然后使人消瘦、再次感染，直至死亡，這是寵物蛇貿(mào)易中的一個大問題。對于該病的起因，獸醫(yī)也一無所知。出于好奇，DeRisi和Stenglein決定去看看病毒是否應(yīng)該為此負責(zé)。

通過與蛇主和獸醫(yī)合作，該團隊進行了宏基因組測序并且找到了感染包涵體病的蛇體中存在沙粒病毒的證據(jù)。當Stenglein想要試著去培養(yǎng)這些新的病毒時，麻煩開始了。普通的對沙粒病毒友好的哺乳動物細胞系根本不起作用。“ATCC總共就有四種爬行類動物細胞系，因此我們?nèi)加嗁徚恕！盨tenglein說，但是在其中任何一種細胞系上，病毒都無法復(fù)制。

通過他們聯(lián)系到的新獸醫(yī)，Stenglein和DeRisi收集了來源于一條名為Juliet的大蟒蛇（死于淋巴瘤）的組織。Stenglein隨后試驗了多種分離方法來無限增殖Juliet的細胞。“這就有點像那種乘法問題，你要是開始改變條件，它就會迅速失去控制，” Stenglein說，他一次就在溫箱中培養(yǎng)了50~100個平板的細胞。為了保持問題可控，他盡可能地將可變因素最小化。

例如，他只用了一種細胞培養(yǎng)基配方：最小必須培養(yǎng)基（minimal essential medium，MEM）——這是一種最初由Harry Eagle所發(fā)明的溶液，可以維持許多細胞的基本需求。最近，大量的其他培養(yǎng)基也得到研發(fā)，用來迎合有特殊需求的用戶，包括敏感和難以培養(yǎng)的細胞以及來源于不同物種的細胞系。

Stenglein也在相同的溫度下培養(yǎng)所有的平皿，僅僅改變細胞提取的方法。最終有效的方法是利用手術(shù)刀簡單地將組織切成片，然后將它們浸入胰蛋白酶中進行過夜培養(yǎng)。最終這種方法產(chǎn)生了兩種新的細胞系，一種來源于Juliet的腎臟，另一種來源于它的脾臟。

這些新的細胞系現(xiàn)在已經(jīng)通過多種渠道傳播出去。利用這些細胞系，研究人員研發(fā)出了檢測新型沙粒病毒的方法，并將其使用在未患和已患包涵體病的蛇體中。由于該結(jié)果顯示沙粒病毒感染與包涵體病有很強的相關(guān)性，說明該病毒可能引起了這種疾病。

Stenglein現(xiàn)在將研發(fā)新細胞系單純視為他可以在未來使用的另一項實驗室技術(shù)——盡管他還沒有近期的研究計劃。“我只會在某個研究項目有需要的時候去做。”他說道。然而，他強烈建議其他人去考慮構(gòu)建新細胞系，特別是如果他們所研究的物種是大的保藏庫中沒有得到充分代表的物種。“這并沒有你想象得那么難，如果你所處的情況是你的研究問題將會因擁有一個（新的）細胞系而獲益，那么你值得去試試。”

對于那些研究爬行動物的人，DeRisi的實驗室愿意將Juliet的細胞系分享給任何感興趣進行研究或使用的人。他們的確想要將細胞系提供給保藏庫，但是遭到了拒絕。

培養(yǎng)的寶庫

的確，想要從“外源”物種中構(gòu)建其他細胞系的研究人員可能也會從保藏庫中得到相似的回應(yīng)，首要原因是經(jīng)費。“早先ATCC確實有政府的經(jīng)費支持，因此我們愿意接受研究人員的任何請求，做了細胞銀行、細胞鑒定來確保這種系是它應(yīng)該有的樣子，并將它們擴散和分送到世界各地。”Tian說。然而，保藏庫的政府經(jīng)費早在20年前就停止了，因此迫使ATCC變得更加挑剔。目前，該非盈利機構(gòu)只能加入那些他們認為具有高需求和廣泛科學(xué)興趣的新細胞系。

Coriell研究所仍然具有充足的聯(lián)邦經(jīng)費支持，但是他們的關(guān)注點在于人類和非人的靈長類細胞系。該研究所維持了一個具有數(shù)千樣品的寶庫，范圍涵蓋了從臍帶血到患罕見遺傳疾病的患者臨床分離樣品。

除了存儲現(xiàn)有的細胞系，在構(gòu)建新細胞系方面，保藏庫也處于領(lǐng)先。

構(gòu)建新細胞系最簡單的方式是去修飾一個現(xiàn)有的細胞系，這是當已知細胞系已經(jīng)能夠近乎滿足各種需求時的常用策略。優(yōu)化培養(yǎng)特定病毒或最大化重組蛋白產(chǎn)出的細胞經(jīng)常來源于這種修飾。建立一個全新的細胞系有時需要更多外源的技術(shù)。傳統(tǒng)的試湊法（cut-and-try methods）如Stenglein所使用的方法可能會有效，但是專業(yè)的細胞系研發(fā)者仍然在不斷地尋找方式來加速整個過程。部分由于對如Gey的HeLas細胞系等的細胞系研究，研究人員現(xiàn)在知道無限增殖最快捷的一條途徑是通過病毒感染。例如，來源于SV40的大T抗原，或者來源于人類乳頭狀瘤病毒的E6和E7原癌基因，可以快速地將原代細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)換為無限增殖細胞系。

由于病毒原癌基因能有效地將細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤，它們趨向于改變細胞的特性。現(xiàn)有的原癌基因也有某種限制范圍，它們并不能在所有的細胞型上起作用。這也正是為什么許多細胞培養(yǎng)專家現(xiàn)在在病毒原癌基因基礎(chǔ)上或代替病毒原癌基因，使用一種人類端粒反轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）。hTERT技術(shù)最初研發(fā)于1999年，這種技術(shù)能夠產(chǎn)生表現(xiàn)出原初培養(yǎng)特性，但繁殖起來卻像無限增殖細胞系。

腫瘤樣品已經(jīng)獲得無限復(fù)制的能力，但常常需要一點幫助才能實現(xiàn)無限增殖。 對于原淋巴細胞來說，最容易的方法經(jīng)常要使用Epstein-Barr病毒來感染細胞，這樣在自然轉(zhuǎn)化細胞的同時保持了大部分的正常生理活性。

Tian建議那些認為自己需要新細胞系的研究者，先查閱文獻和保藏庫的數(shù)據(jù)庫。相似的細胞系經(jīng)常能夠通過修飾來滿足科學(xué)家的需求，比重新構(gòu)建一個新系要更快更便捷。如果現(xiàn)存的細胞系沒有一個比較接近，下一步就是決定無限增殖原初細胞的通用策略。“如果你想要建立一個腫瘤（細胞系），那么一個自然形成的細胞系就有很大的可能性，但是如果你想要得到非腫瘤性的正常細胞系，那么hTERT……和病毒感染就是最通用的手段。”Tian說。

無論有沒有額外的原癌基因，一些公司為hTERT無限增殖細胞提供完整的試劑盒，如位于加拿大不列顛哥倫比亞里士滿的應(yīng)用生物材料公司。德國海德堡的BioCat GmbH公司也售賣建立好的細胞系和細胞無限增殖所需的試劑。此外，研究人員可以直接將他們的原初細胞寄給BioCat公司，并由公司來構(gòu)建細胞系。

無論采用哪種構(gòu)建新細胞系的特定技術(shù)，任何類型細胞培養(yǎng)的常見問題依然會出現(xiàn)，例如微生物污染。支原體尤其難以處理，因為它們常常在培養(yǎng)物中不經(jīng)意長出，并且悄悄地毀滅整個實驗。來自ATCC、Lonza和InvivoGen的檢測試劑盒能夠鑒定這種神秘的入侵者。能防止污染當然更好，培養(yǎng)箱制造商已經(jīng)試著通過改進設(shè)計以防止污染，采用的特性包括如用易于清潔的臺面，自動化去污染循環(huán)和整體的空氣過濾。

為蝙蝠辯護

盡管巧妙的技術(shù)有時能加速研發(fā)過程，但是每個細胞系派生出的問題都是獨特的，就像Eric Donaldson若干年前發(fā)現(xiàn)的那樣。作為位于馬里蘭州巴爾的摩馬里蘭醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)和免疫學(xué)助理教授Matthew Frieman的博士后研究員，Donaldson當時正在尋找一種冠狀病毒。冠狀病毒家族中包括了導(dǎo)致傳染性非典型肺炎（SARS）和中東呼吸綜合征（MERS）的病毒，這種病毒在蝙蝠體內(nèi)很常見。遺憾的是，這些病毒一直難以從它們的自然儲藏庫中分離出來。

Donaldson想到，一種來源于蝙蝠的新型細胞系可能會有幫助。他很快發(fā)現(xiàn)研究蝙蝠的生物學(xué)家比和Stenglein打交道的蛇類愛好者更保守。“研究蝙蝠的生態(tài)學(xué)家非常注重于保護蝙蝠，因此我用了很長時間才敲開他們的門。” Donaldson說， 他現(xiàn)在是位于馬里蘭州銀泉市美國食品藥品監(jiān)督局的病毒審核員。他補充道，他不得不向蝙蝠生物學(xué)家證明，他的興趣在于幫助這些動物而不是摧毀它們。

最終，Donaldson和Frieman與一家位于弗吉尼亞州安南達爾的蝙蝠保護項目“拯救露西運動”建立了聯(lián)系。一旦蝙蝠被汽車擊中或者遭遇不明傷害無法救助時，“拯救露西”的志愿者就聯(lián)系Donaldson，他們隨后開車到該機構(gòu)中心，在這些動物死后立即收取它們的組織。

因為蝙蝠可能會攜帶危險的人類病原，包括狂犬病毒，研究人員需要在配備了安全柜和限制性開放的生物安全防護二級（BSL-2）以上的實驗室來針對這些組織開展研究。Donaldson使用了細胞分選儀來分離每個組織中的細胞，然后將hTERT和一個稱為BMI-1的小鼠原癌基因引入到細胞中，試著進行無限增殖。絕大多數(shù)的實驗都失敗了，包括來自代表了4個物種的10只蝙蝠的多種組織。

“但是當它成功時，我們驚嘆，天哪，真的成功了。” Donaldson說。他解釋說在其中一個實驗，“我們在第一天接種了原代細胞，兩到三天后培養(yǎng)瓶中就（滿是細胞），我們最終在四次培育后得到了如此多的細胞，都不知道如何處置它們。”該團隊最終從三種不同的蝙蝠中構(gòu)建了三個細胞系，并且能夠在這些新細胞系中培養(yǎng)全新的冠狀病毒。

從三個物種中構(gòu)建新的細胞系令人欽佩，然而蝙蝠是在進化上最多樣的哺乳動物類群，流行病專家開始越來越懷疑它們可能是大量新興病原體的攜帶者。這也是位于德國波恩的波恩大學(xué)醫(yī)學(xué)中心病毒學(xué)研究所研究人員Isabella Eckerle試圖建立更多的蝙蝠細胞系的原因。

起初，Eckerle遇到了與Donaldson同樣的障礙：蝙蝠的組織難以獲得。在研究這個問題的同時，她開始在豬的細胞中試驗她的組織培養(yǎng)方法，建立了將多種原初組織轉(zhuǎn)化為無限增殖細胞系的操作步驟。她也創(chuàng)造了一種在野外快速冷凍細胞的技術(shù)。“這是我真正樂于去做的事情，因此我們無需外出并且犧牲蝙蝠，但我們還能與目前已經(jīng)進行的項目相銜接。” Eckerle說。

當她最終獲得一些蝙蝠組織時，Eckerle和她的同事們從兩個蝙蝠物種的呼吸道上皮細胞中構(gòu)建了新的細胞系，這兩種蝙蝠代表了兩個主要的蝙蝠亞目：Yangochiroptera和Yinpterochiroptera。“蝙蝠可能是最重要的空氣傳播病毒家族的主要宿主，如副粘病毒、冠狀病毒或者是最近在蝙蝠中發(fā)現(xiàn)的流感病毒。”Eckerle說。通過仔細解剖微小的氣管并建立原初培養(yǎng)，她使用SV40 T抗原來實現(xiàn)無限增殖。她和她的同事目前正在從其他蝙蝠組織以及其他種中構(gòu)建額外的細胞系。

正如該領(lǐng)域的其他人一樣，Eckerle也同意建立新細胞系很容易使人有挫敗感，但是她認為回報是值得的：“因為這些模型十分新穎，你可以用它們來做許多事情。”

原文檢索：The Art Of Culture: Developing Cell Lines

轉(zhuǎn)載自生物360