敏泰元生物 — 細胞與免疫學專業服務平臺
免疫組化原理、步驟及應用
發布日期：2012-11-08 瀏覽次數：10011
免疫組化原理、步驟及應用
用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry，ICC）技術。
根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。
 |
- 1、按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。
- 2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
- 3、按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內源性生物素含量高的組織抗原檢測。
- 1、免疫熒光方法
- 免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。
- 2、免疫酶標方法
- 免疫酶標方法是繼免疫熒光后，60年代發展起來的技術。基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。該方法與免疫熒光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統等。
- 3、免疫膠體金技術
- 免疫膠體金技術是以膠體金金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。
- 1、特異性強。免疫學的基本原理決定抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會出現交叉反應。
- 2、敏感性高。ABC法或SP三步法使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規病理診斷工作。
- 3、定位準確、形態與功能相結合。該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學領域開展深入研究是十分有意義的。
- 1、Western blotting：蛋白質免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學發光等技術來檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術相比，定量可能更加準確；當然Western blotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進而間接反映它們的定位），但敏感性遠遠低于免疫組化技術。
- 2、ELISA：酶聯免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原結合反應原理來檢測體液或組織勻漿中蛋白含量。與免疫組化技術相比，定量最準確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。
流程簡介
- 1）石蠟切片，常規脫蠟至水。
- 2）0.3%或3%H2O2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物酶活性。
- 3）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。
- 4）候選步驟：采用抗原修復：微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻。
- 5）血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
- 6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（最好復溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
- 7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。
- 8）PBS沖洗，3分鐘×5次。
- 9）滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。
- 10）PBS沖洗，3分鐘×5次。
- 11）顯色劑顯色（DAB等）。
- 12）自來水充分沖洗。
- 13）可進行復染，脫水，透明。
- 14）選擇適當的封片劑封片。
 |
| 免疫組化ABC法 |
- 1) 4%多聚甲醛常規灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）過夜，蠟塊制作，切片，貼片。0.01M PBS清洗5min×3次；
- 2) 脫蠟、水化：用二甲苯兩次10min，用梯度乙醇由低濃度到高濃度進行水化；
- 3) 加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01M PBS 100ml＋30%過氧化氫）30min，以消除內源性過氧化物酶的影響，0.01M PBS清洗5min×3次；
- 4) 加入0.3% Triton X-100（0.3ml Triton X-100＋0.01 M PBS 100ml）30min，以增加細胞的通透性，0.01M PBS清洗5min×3次；
- 5) 加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01M PBS 100ml＋疊氮納0.08g）稀釋的一抗，4℃過夜。吸去抗體，0.01M PBS洗5min×3次；
- 6) 加入0.01M PBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01M PBS洗5min×3次；
- 7) 加入ABC復合物之類的抗體，室溫孵育2h，0.01M PBS洗5min×3次；蒸餾水迅速沖三次；
- 8) 加入顯色液，進行免疫組織化學顯色，時間一般3~10min，可不時在顯微鏡下進行觀察，待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速沖三次后加入0.01M PBS終止反應；
- 9) 蘇木素復染；
- 10) 梯度酒精脫水之后，透明，封片，拍照。
- 1、應用于腫瘤分期
- 免疫組化通過顯示基底膜缺無或明顯斷裂來確定有微浸潤腫瘤的早期，還可以檢測骨髓及淋巴結隱匿性轉移癌。
- 2、檢測腫瘤相關抗原：甲胎蛋白（AFP、甲狀腺球蛋白（Tg））等
- 3、檢測腫瘤細胞增生標志物
- 目前被廣泛采用的兩種增殖相關標志物是Ki-67及PCNA（增埴細胞核抗原）。Ki-67與PCNA免疫反應性與細胞增生的形態學特征關系密切，特別是與有絲分裂數及腫瘤分級相關。在乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、肝癌、胃癌和一些淋巴瘤及肉瘤，采用Ki-67與PCNA免疫組化分析，均顯示有增殖證據，提示這些腫瘤病人更容易進展。高Ki-67及PCNA標記指數病人無病生存率及總生存率明顯下降。
- 4、檢測癌基因產物和抑癌基因產物：c-erbB-2、表皮生長因子受體(EGFR)、P53等
- 5、預測治療反應
- 例如，免疫組化可預測乳腺癌對激素治療的反應性。無ER或PR表達的腫瘤對激素治療通常反應性差，而ER及PR陽性腫瘤則對激素治療反應性高。
- 6、應用于臨床病理診斷
- 許多腫瘤組織細胞在顯微鏡下看起來非常相似，以致于病理醫生難以完全準確地判斷出腫瘤的性質。使用免疫組化檢測腫瘤細胞的表面和細胞內特異性的物質表達，有助于明確腫瘤的性質和組織來源。
【上一篇】western blot原理及步驟
【下一篇】BD PMG協助發現調控T細胞分化增殖的關鍵因素