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western blot原理及步驟
發布日期：2012-10-29 瀏覽次數：10075
western blot原理及步驟
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。Western blot技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白，廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
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| Western Blot原理圖 |
Western Blot實驗步驟圖
- 1.樣品制備：
- 根據樣本不同，分為組織處理法、細胞處理法和分泌蛋白的提取。 注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。
- 2.電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）：
- 蛋白電泳分離常用SDS-PAGE電泳方法。SDS是一種陰離子去污劑、變性劑，氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束。蛋白質-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異，與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質分子線性化。
- 凝膠濃度與所分離蛋白大小的關系如下表
凝膠濃度（％） 線性分離范圍（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 - A.做膠前的準備
- （1）檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。
- （2）檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。
- （3）按將要檢測的抗體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。
- B.制膠，電泳
- （1）裝好架子。
- （2）配制分離膠，在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好地凝集。
- （3）待分離膠凝集后，配制濃縮膠，倒好后插入預先準備好的梳子。
- （4） 待膠凝集好后，上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。
- 3.轉膜
- 蛋白質常用的轉移方法主要有兩種：槽式濕轉和半干轉移。前者操作容易，轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉的操作步驟。
- （1）將膠浸于轉移緩沖液中平衡10min。注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。
- （2） 依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。
- （3）裝配轉移三明治：海綿3層-濾紙-膠-膜-3層濾紙-海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負極面（黑色面）。
- （4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。
- （5）轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。
- 4.封閉、抗體孵育與洗滌
- 蛋白質常用的轉移方法主要有兩種：槽式濕轉和半干轉移。前者操作容易，轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉的操作步驟。
- （1）用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。
- （2）置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。
- （3）15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
- （4）加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或 4°C過夜，緩慢搖動。
- （5）15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
- （6）加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。
- （7）15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
- （8）15 ml TBS洗1次。
- 注意事項：
- 1．操作中戴手套，不要用手觸膜。
- 2．PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。
- 3．如檢測小于20kD的蛋白應用0.2μm的膜，并可省略轉移時的平衡步驟。
- 4．某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。
- 5．關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內源性交叉反應性。
- 6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。
- 如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。
- 5.檢測
- （1）二抗與底物反應顯色的方法主要有以下兩種：
- ? 化學發光（Chemiluminescent）：靈敏度高，已經達到pg級別，甚至還有Femto級別；
- ? 底物顯色：包括辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP、葡萄糖氧化酶等。
- （2）二抗熒光標記法
- 1、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺：應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。
- 2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液：10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。
- 3、 分離膠緩沖液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后4℃保存。
- 4、 濃縮膠緩沖液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后4℃保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調節PH值，而不用Tris.CL。
- 5、 TEMED原溶液：N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數ml，臨用前配制。
- 6、 SDS-PAGE加樣緩沖液：pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。
- 7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。
- 8、 轉移緩沖液：配制1L轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。
- 9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。
- 10、 脫脂奶粉5%(w/v)。
- 11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
- 12、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
- 13、 Tween20
- 14、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
- 15、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
- 16、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
- 17、 100mmol/L NaCl。
- 18、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
- 分離膠 (單位：ml，Total： 8ml)
7.5％ 10％ 15% 2×Sep. buffer 4 4 4 30％ Gel.sol 2.0 2.7 4 ddH2O 1.9 1.2 0 TEMED 8ul 8ul 8ul 10%APS 80ul 0ul 80ul - 濃縮膠(單位：ml，Total： 3.5ml)
3％ 2×Stacking. buffer 1.7 30％ Gel.sol 0.35 30％ Gel.sol 2.0 ddH2O 1.4 TEMED 5ul 10%APS 50ul
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