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免疫組化故障排除指南
發布日期：2013-01-22 瀏覽次數：4210
免疫組化故障排除指南
| 原因 | 解決方案 |
| 組織處理 | 組織處理過程中抗原可能已經被破壞。 |
| 免疫染色前，確保組織的正確處理。使用適當的固定劑、固定時間、包埋試劑和包埋技術。使用適當的切片設備和技術。免疫組化所用的組織切片厚度建議為4um。對于福爾馬林固定的石蠟包埋組織，確保切片完全脫蠟和水化。需要時，請更換新的二甲苯和酒精。 | |
| 抗原修復（表位釋放） | 確定最佳的抗原修復條件。嘗試不經抗原修復，直接進行組織切片的染色。 |
| 使用抗原熱修復法（HIER）。調試并維持特定的溫度。調節pH值（選用合適的緩沖液）。調整加熱時間。 | |
| 使用抗原酶修復法（EIER）。選用合適的酶（如蛋白酶K）。調整孵育時間。在室溫或加熱的條件下進行抗原修復。 | |
| 一抗 | 按照說明書的要求準備抗體。 |
| 抗體開瓶前離心。 | |
| 抗體重懸后，離心去除任何可能的聚集物。 | |
| 抗體分裝、凍存于-20℃。避免反復凍融。 | |
| 在有效期內使用抗體。 | |
| 增加抗體的濃度。 | |
| 延長孵育時間（如抗體4℃過夜）。 | |
| 二抗 | 針對一抗，選用合適的二抗或檢測系統。 |
| 增加二抗的濃度和孵育時間。 | |
| 檢測系統 | 使用合適的檢測系統。 |
| 確保酶和底物相匹配（如DAB底物需要與HRP酶配合使用）。 | |
| 試劑使用順序要正確。 | |
| 進行適當的清洗。 | |
| 在室溫使用顯色組分。 | |
| 在有效期內使用顯色組分。 | |
| 使用檢測放大系統，如Polymer檢測法或酪胺信號放大技術。直標法檢測的放大作用小，可能導致信號輕度弱。 | |
| 疊氮鈉是HRP酶的抑制劑，在某些試劑，如HRP標記的二抗中存在時可能會干擾染色結果。其它試劑中存在的少量疊氮鈉不會影響免疫染色結果。 | |
| 抗原 | 待測抗原可能不存在于特定的組織中，或者抗原的表達水平太低而無法檢測出。 |
| 在組織處理或抗原修復期間，抗原表位可能受到破壞。如果單克隆抗體所針對的特定的抗原表位被掩蓋或破壞，使用該單抗進行染色，則無信號。應該重新染色或處理新的組織樣本。 | |
| 使用其他實驗方法來檢測抗原是否存在（如原位雜交法）。 | |
| 顯色底物 | 調整孵育時間。檢查底物是否出現沉淀。 |
| 對不同的底物，選用合適的封片劑，（比如，可使用永久封片劑封固DAB染色的玻片，而不溶于酒精的AEC底物則需要使用水溶性封片劑）。 |
| 原因 | 解決方案 |
| 組織處理 | 免疫染色前，確保組織的正確處理。使用適當的固定劑、固定時間、包埋試劑和包埋技術。使用適當的切片設備和技術。免疫組化所用的組織切片厚度建議為4um。對于福爾馬林固定的石蠟包埋組織，確保切片完全脫蠟和水化。需要時，請更換新的二甲苯和酒精。 |
| 抗原修復 | 組織可能被過度修復。調整孵育時間、溫度。如必要，使用其他抗原修復方法。嘗試不經抗原修復，直接進行組織切片的染色。 |
| 一抗 | 按照說明書的要求準備抗體。 |
| 抗體開瓶前離心。 | |
| 抗體重懸后，離心去除任何可能的聚集物。 | |
| 抗體分裝、凍存于-20℃。避免反復凍融。 | |
| 在有效期內使用抗體。 | |
| 降低抗體濃度，調整抗體的孵育時間。 | |
| 在組織樣本與蛋白封閉液共同孵育后，立即加入一抗進行孵育。 | |
| 二抗 | 調整二抗的濃度。使用不易出現非特異性結合的二抗（如交叉吸附的抗體或F(ab')2片段抗體）。 |
| 檢測系統 | 使用不易出現非特異結合的檢測系統。 |
| 調整孵育時間。 | |
| 非特異性結合 | 封閉內源性分子和高電荷分子。 |
| 內源性分子 | 某些類型的組織和染色過程中，可能會存在內源性分子并影響染色。請為各種類型的組織確定必要的封閉步驟，例如，封閉內源性分子（包括內源性生物素、內源性過氧化物酶和內源性磷酸酶）或Fc受體等。 |
| 如果內源性分子很難被徹底封閉，請選用其它染色方法（例如，在富含生物素的肝臟上采用非生物素檢測法）。 | |
| 蛋白封閉液 | 使用來自二抗宿主動物的蛋白封閉液或血清封閉液，以防止非特異性結合（抗體為高電荷蛋白質，其分子的疏水性可能導致非特異性染色）。 |
| 在一抗孵育之前，先將組織樣本與蛋白封閉液共同孵育。 | |
| 清洗不充分 | 增加清洗時間和/或清洗次數。根據不同的染色系統使用具有適當pH值的緩沖液（如PBS或Tris清洗緩沖液）。添加Tween-20等去污劑，以降低疏水相互作用。 |
| 顯色底物 | 調整孵育時間。如果可能的話，調整顯色底物的濃度。檢查是否出現沉淀，切勿使用過期產品。 |
| 組織切片變干 | 在免疫染色過程中，不要讓組織切片變干。組織孵育期間，請使用濕盒和足量的試劑。使用PAP免疫組化筆在組織切片周圍畫出一圈疏水屏障，以確保組織始終被試劑覆蓋。 |
| 原因 | 解決方案 |
| 試劑過期 | 在免疫染色過程中，檢查所有試劑的有效期。 |
| 對照 | 確保陽性對照、陰性對照有效。 |
| 表面活性劑清洗 | 增加表面活性劑清洗的步驟，以增強試劑的穿透能力（例如在PBS中加入0.2% Triton X-100）。 |
| 封片劑 | 為每種顯色底物選用適當的封片劑（不同的顯色底物可能需要水溶性或非水溶性封片劑）。 |
| 襯染 | 使用合適的襯染時間。 |
| 自動染色 | 檢查機器，確保參數正確。 |