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Western Blot常見問題及解決方案2
發布日期：2013-01-21 瀏覽次數：5126
Western Blot常見問題及解決方案2
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白質含量不足 | 增加樣本中的蛋白質含量。 |
| 通過其他方法確認樣本中是否存在蛋白質。 | |
| 凝膠電泳時間過長 | 減少凝膠電泳時間。觀察凝膠中染料前端的位置，確保當染料前端接近凝膠底部時斷開電源。 |
| 樣本陳舊或其中的蛋白已降解 | 測試含目標蛋白的新鮮樣本。 |
| 蛋白轉膜過度或未正確轉膜 | 使用孔徑較小的膜。 |
| 對于低分子量（小于10KDa）的蛋白質，降低轉膜電壓。 | |
| 優化轉膜時間，轉膜時間與蛋白分子量大小密切相關。 | |
| 正確安裝“三明治夾層”，保證凝膠與膜之間充分接觸；確保使用正確的轉膜緩沖液。 | |
| 使用硝酸纖維素膜時，轉膜時存在SDS，會降低蛋白與膜之間的結合。 | |
| 在轉膜緩沖液中加入20%的甲醇，會增加蛋白與膜的結合能力。 | |
| 使用可逆性染色液（如麗春紅）染膜，以顯示主要條帶，從而檢查蛋白質的轉膜情況。 | |
| 蛋白質被封閉液遮蓋 | 換用其他封閉液。 |
| 調整封閉液中的蛋白質濃度，建議使用含3%脫脂干奶粉的蒸餾水（dH2O）溶液。 | |
| 存在酶抑制劑（如疊氮化物） | 確保緩沖液中不含疊氮鈉，否則將影響HRP活性。 |
| 一抗陳舊或降解 | 確保抗體在有效期范圍之內。 |
| 盡量避免抗體反復凍融，可能會影響抗體的結構以及蛋白與抗體之間的結合。 | |
| 一抗和/或二抗的量不夠 | 查看生產廠商的抗體推薦濃度。 |
| 做濃度梯度，以摸索最佳濃度。 | |
| 用錯一抗 | 確保一抗的反應種屬性正確（如要檢測人VEGF，則應使用兔抗人的VEGF抗體作為一抗）。 |
| 用錯二抗 | 確保使用的二抗是針對一抗來源種屬的抗體（如一抗為兔抗人VEGF，那么二抗需用驢抗兔）。 |
| 一抗孵育時間不足 | 增加一抗的孵育時間。抗體可在室溫孵育1小時以上或在4℃孵育過夜。 |
| 二抗孵育時間不足 | 適當增加二抗的孵育時間。 |
| 洗膜過度 | 縮短洗膜時間和/或減少洗膜次數。 |
| 使用不含去污劑或去污劑濃度較低的清洗緩沖液。 | |
| 顯色劑不對 | 確保使用的顯色試劑與酶標記物相配。 |
| 確保遵循生產廠商的說明正確配制底物。 | |
| 鹽含量過高 | 降低清洗緩沖液中的鹽含量。 |
| 降低抗體稀釋緩沖液中的鹽含量。 | |
| 顯色劑降解/錯誤 | 確保顯色劑的配制方法無誤。 |
| 檢查顯色劑是否仍有活性。 | |
| 對于ECL方法，膠片不好/過期 | 確保膠片未過期或曝光。 |
| 對于ECL方法，ECL顯色液陳舊/過期 | 使用新鮮的ECL顯色液。 |
| 對于ECL方法，膠片曝光時間太短 | 延長膠片的曝光時間。 |
| 對于ECL方法，保鮮膜影響顯色反應 | 換用其他品牌的保鮮膜。 |
| 原因 | 解決方案 |
| 抗體濃度過高 | 查看生產廠商對一抗/二抗的推薦工作濃度 |
| 做一系列濃度梯度，摸索最佳條件。 | |
| 抗體孵育時間過長 | 確保采用正確的孵育時間和溫度。 |
| 抗體的非特異性結合 | 確保一抗僅對目標蛋白具有特異性。 |
| 省略一抗孵育步驟進行質控，若仍出現目的條帶，請選用其他二抗。 | |
| 使用其他種屬來源的二抗。 | |
| 抗體與封閉液和/或樣本中的蛋白發生交叉反應 | 使用其它封閉液配方。 |
| 比如山羊抗體可輕微識別牛的蛋白質，因此山羊抗體能與BSA（牛血清白蛋白）發生交叉反應，將導致膜上出現紫色光澤。這種情況請使用其它種屬來源的抗體或其它封閉液。 | |
| 如果懷疑二抗有問題，請使用含1-5%正常血清（來自與目的蛋白相同的種屬）的緩沖液稀釋抗體。 | |
| 封閉液無效 | 使用其它封閉液配方。 |
| 在封閉液中加入去污劑，如Tween-20。 | |
| 封閉不充分 | 使用其它封閉液配方。 |
| 該批次的封閉液可能已失效，使用新鮮封閉液。 | |
| 低溫可能會降低封閉效率，4℃封閉過夜的效果不一定好。嘗試室溫封閉一小時，并在封閉液中添加Tween-20。 | |
| 清洗不充分 | 在每個步驟后，洗膜3次，共10分鐘。如果還不夠充分，適當延長清洗步驟的時間。 |
| 嘗試向清洗緩沖液中添加其它去污劑；或者，如果緩沖液中沒有任何去污劑，請添加Tween-20。 | |
| 增加清洗緩沖液的用量。 | |
| 與顯色底物的孵育時間過長 | 縮短顯色溶液的孵育時間。監測顯色過程，直至出現條帶，然后在蒸餾水中洗膜以終止反應。 |
| 酶過量 | 降低所用酶標記物的濃度。 |
| 受內源性物質的干擾 | 脫脂奶粉中含有內源性生物素，會干擾親和素/生物素檢測系統。這種情況換用其它封閉液，如3%的BSA。 |
| 試劑被污染 | 使用前對緩沖液進行過濾，以去除污染物。 |
| 配制新鮮的緩沖液，并重新進行Western Transfer實驗。 | |
| 膜有問題 | 換用新的膜。 |
| 整個實驗過程中，僅在轉膜與免疫染色交替之間的階段允許膜變干。一旦開始免疫染色，則在該過程完成之前，不能使膜變干。如果膜在免疫過程中出現干燥，應重新進行Western Transfer實驗。 | |
| 對于ECL方法，ECL膠片曝光過度 | 縮短膠片曝光時間。 |
| 如果目標蛋白的信號太強，請等待5-10分鐘后重新對膠片進行曝光。 |
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