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ELISA實驗注意事項
發布日期：2013-01-04 瀏覽次數：4405
ELISA實驗注意事項
- 1.試劑
- 目前市場上已經有很成熟的ELISA試劑盒，省去了繁瑣的試劑配制過程、大大簡化了實驗步驟、節省實驗者寶貴的時間。
- 提供ELISA試劑盒的廠家有很多，比如Merck Millipore、Peprotech、CST、BD等公司。其中，Peprotech推出的MiNi ELISA KIT，大約可分析200 個ELISA 板（如目錄號：900-M98 ），比較適合分析量較小的用戶。除了蛋白、細胞因子等ELISA檢測試劑盒，針對小鼠、人等物種，Merck Millipore有多種細胞因子檢測panel。例如（目錄號：MPXMCYTO-70K），可同時檢測32種細胞因子，并且用戶可根據需要，從中挑選、組合自己需要的細胞因子。
- 2.器材
| 試劑 | 配制方法 |
| 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液) | NaCO3 1.59克、NaHCO3 2.93克 ，加蒸餾水至1000ml。 |
| 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS) | 0.15M KH2PO4 0.2克，Na2HPO4?12H2O 2.9克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05％ 0.5ml ，加蒸餾水至1000ml。 |
| 稀釋液 | 牛血清白蛋白(BSA) 0.1克，加洗滌緩沖液至100ml；或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。 |
| 終止液(2M H2SO4） | 蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。 |
| 底物緩沖液(PH5.0磷酸檸檬酸) | 0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml ， 0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml，加蒸餾水50ml。 |
| TMB(四甲基聯苯胺)顯色液 | TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml，底物緩沖液(PH5.5) 10ml，0.75％H2O2 32μl。 |
| ABTS顯色液 | ABTS 0.5mg，底物緩沖液(PH5.5) 1ml，3％H2O2 2μl。 |
| 抗原、抗體和酶標記抗體 | |
| 正常血清和陽性對照血清 |
| 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔 | ELISA檢測儀 |
| 50μl及100μl加樣器 | 37℃孵育箱 |
| 洗滌瓶 |
- 1.應分別以陽性對照與陰性對照控制實驗條件，待檢樣品應分兩份，以保證實驗結果的準確性。如果本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
- 2.各項實驗條件的選擇很重要，包括:
- (1)固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
- (2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，一般要求PH在9.0～9.6。吸附溫度、時間及蛋白量也有一定影響,多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被后，在其它實驗條件相同的情況下，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
- 用于ELISA檢測的抗體，純度一定要好。Abcam、Merck Millipore、BD、Peprotech、CST等公司都有高質量的、專門用于ELISA檢測的抗體。其中，Abcam公司的抗體較全、Peprotech、CST公司的抗體較專。
- (3)酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定，然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。
- (4)酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的要求是安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
- 其中，TMB用在HRP系統中，對應的檢測波長是450nm。加入HRP結合的二抗孵育后，再加入TMB進行顯色。Merck Millipore公司（目錄號：613544-100ML、ES022-500ML）和CST公司都有不同規格的TMB（目錄號：7004S、7004L）。
- ABTS也是HRP的底物之一，對應的檢測波長是405nm。ABTS比TMB敏感，顯色慢。但是重復實驗時比較容易控制顯色時間，結果較一致。Merck Millipore公司同樣也有兩種規格的ABTS（目錄號：ES004-100ML、ES004-500ML）。
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