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RIP技術原理及相關產品

發布日期:2012-12-10  瀏覽次數:5976  

RIP技術原理及相關產品

  • 序言
  • 95%的人類基因組并不編碼基因,而是產生大量的非編碼RNA,真正編碼蛋白質的基因只占人類總基因組的約2%。這些非編碼RNA在生長發育的各個階段都發揮著重要的調節作用,與艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多種病變密切相關,并且參與著干細胞和表觀遺傳學調控。RNA結合蛋白(RBPs)通過細胞核或細胞質中的RNA識別基序(RRM)或者RNA結合區(RBD)來結合RNA,這種結合作用取決于RBP的類型和所結合的RNA序列。而RNA-蛋白復合物驅動了幾乎所有細胞過程的基因表達的轉錄后調控,包括剪接(splicing)、出核轉運(nuclear export)、mRNA 穩定性以及蛋白轉譯過程。因此,對基因調控的了解就有賴于確定這些過程中RNA的結合的變化,RNA研究也被越來越多的科學家重視。RIP技術逐漸成為RNA研究領域的一項常規方法,特別是轉錄后調控網絡;同樣也是研究腫瘤發生和轉移中microRNA失調的有力工具。
  • 一.RIP技術定義
  • RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄后調控網絡動態過程的有力工具,能幫助發現miRNA的調節靶點。RIP技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP是染色質免疫沉淀ChIP技術的類似應用,但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物,RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同(如復合物不需要固定,RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶,抗體需經RIP實驗驗證等)。RIP技術下游結合microarray技術被稱為RIP-Chip,更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。
  • 二.RIP 實驗基本原理
  • RIP用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白,RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來,結合的RNA序列再通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定 。
  • 三.RIP實驗流程
  • 首先對細胞進行裂解;在裂解液中加入抗體及蛋白A/G磁珠,接著用磁極固定磁珠復合物,并洗脫未結合的蛋白-RNA復合物;提取蛋白-RNA中的RNA,純化后進行下游實驗,如qRT-PCR,微陣列(RIP-Chip)、高通量測序(RIP-Seq)等。
  • 四. RIP優勢
  • RIP的一大優勢在于,通過MS(質譜技術),RIP可以同時鑒定RNPs中的蛋白組分和其相關聯的調控蛋白。環境條件的改變或者在細胞分化過程中,RNP復合物會發生重塑,而RNA mapping和MS技術可以對這種重塑進行檢測。
  • 五.產品
  • 作為表觀遺傳學研究的領軍者,默克密理博(Merck Millipore)總結了其在研究DNA與蛋白相互作用的經驗,推出了用于研究RNA與蛋白相互作用的試劑盒(RIP?試劑盒、目錄號:17-700、17-701)以及其他一系列相關產品,為該研究領域的飛速發展提供了便利的條件。
    1. (一)、新型EZ-RIP?磁珠試劑盒:
    2. 1.方便,快速,易于操作。
    3. 2.包括了所有試劑,All-in-one!
    4. 3.提供陰性和陽性對照抗體,對照引物對,特別適用于該技術的初次使用者。
    5. 4.提供優化的磁珠,適于沉淀RNA-蛋白復合物,效率高,非特異性背景低。
    6. 5.高品質,穩定性好。
    7. 6.結果重復率高。
    8. (二)、多種RIP相關抗體
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