RNAscope-原位雜交新玩法
RNAscope-原位雜交新玩法
RNAscope 是基于 ACD(AdvancedCell Diagnostics Inc., Hayward, CA) 的獨特探針設計和信號放大方法的一項新的復合核酸原位雜交技術。RNAscope 方法可替代傳統的 ISH/FISH RNA 原位檢測的方法，同時單分子檢測靈敏度提供了原位對單個細胞基因表達的描繪機會，釋放RNA 生物標記的全部潛能。
迄今為止，這個方法是唯一具有原位檢測人類轉錄組中大多數基因敏感性的平臺，以及在單細胞水平上同時定量多個RNA轉錄。為了大幅提高RNA ISH 的信噪比，RNAscope采用類似于熒光共振能量轉移 (FRET) 的探針設計策略，兩個獨立的探針(雙 Z 探針)必須串聯雜交到目標序列才能引起信號放大發生。因為極不可能出現兩個獨立探針雜交的非特異性目標恰好相鄰確保了只選擇性放大特定目標的信號。
單細胞水平上定量 RNA 原位雜交概況
A.使用RNAscope Multiplex Fluorescent Kit 將 HER2 mRNA可視化并通過計數單個 Hela 細胞信號點量化。使用 DAPI 復染細胞核 ( 藍色 ) 和針對 18srRNA 的探針用作RNA 檢測內參。
B.使用“grind-and-bind”方法 (QuantiGene2)量化一同培養的 Hela 細胞的 HER2 mRNA，以估計單個細胞HER2 mRNA 的絕對拷貝數。這兩個值吻合，說明 ? RNAscope 具有量化能力。
RNAscope 測定過程可在一天之內完成
準備好樣品后, 加入與感興趣的目標 RNA 互補的探針進行雜交。隨后特異性信號放大雙 Z 探測系統 , 立即檢測并通過標準明場顯微鏡或多光譜熒光成像系統量化。
針對為每種目標RNA，設計了一個含大約20對雙Z目標探針的探針庫（pool）用于特異性雜交目標分子，然后通過一連串與前置放大分子、信號放大分子和包含熒光分子或酶顯色分子的標記探針的雜交來實現信號放大。
當前RNAscope 2.0對雙Z探針的設計方法，需要 1kb的特異序列。它可以應用于只有300堿基的目標序列，但是這樣的序列長度無法檢測小編碼或非編碼RNA，如snRNAs、microRNAs、siRNAs、snRNAs、exRNAs、piRNAs--小至 18個堿基。200堿基及以上的長非編碼RNA(lncRNAs)是合適RNAscope技術的目標，這是迄今為止最敏感的可對該類基因進行原位檢測的方法。
這一突破性的方法帶來了眾多優勢其中包括提高靈敏度、特異性、單分子可視化和量化--還可以應用于部分降解的 RNA 樣本(常見于FFPE組織切片)。此方法還支持多通道同時檢測多個RNA標記物，在此之前這中檢測是極難實現，這主要是由于傳統原位雜交很難對多個目標序列找到一個可兼容的探針檢測優化條件。
RNAscope可用于同時觀測基因組中任意4種或4種以上RNA。此外，多個RNA可以使用混合探針檢測方法，如研究人類乳頭狀瘤病毒 (HPV) 時，有 18 株被認為是高危的，可通過混合探針對其同一進行篩選。生物標記物驗證和常規病理診斷可能非常耗時，并且需要數以百計的樣本分析。實驗室為此需要進行高通量的 RNA 分析，ACD 開發的RNAscope 可使用全自動化的染色設備。這些全自動解決方案可用徠卡生物系統的 BOND RX (Leica Biosystems Nussloch GmbH) 和 Ventana 公司的 DISCOVERY ULTRA 及 DISCOVERY XT 系統 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson AZ)。此外，在短短兩周內，可以開發任何公開或專利的目標序列的新探針，為快速開發生物標記物提供可靠的檢測手段。
與傳統的原位雜交相比RNAscope具有更高度的靈敏度
與傳統的非同位素原位雜交相比，在使用RNAscope對石蠟包埋的人類扁桃體組織進行檢測，發現 B 淋巴細胞 IgκmRNA的靈敏性大為改善。RNAscope 或某商業化非放射性同位素 RNA ISH (RISH)對κ輕鏈mRNA染色，以及RNAscope陰性對照(細菌基因dapB)。
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