流式檢測的主要目的是正確區(qū)分陰性和陽性細(xì)胞，并準(zhǔn)確計(jì)算相關(guān)細(xì)胞的比例或數(shù)量，而合理設(shè)置對(duì)照對(duì)于如何劃分陰性和陽性細(xì)胞至關(guān)重要。流式實(shí)驗(yàn)對(duì)照主要分為以下幾類：
空白對(duì)照即不進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光成為自發(fā)熒光，如腫瘤細(xì)胞、含顆粒較多的細(xì)胞或長期培養(yǎng)的細(xì)胞等有相對(duì)較強(qiáng)的自發(fā)熒光。空白對(duì)照主要用于確定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測染色方法是否成功 。陰性對(duì)照的作用是調(diào)節(jié)各熒光探測器合適的放大倍數(shù)，將儀器歸零，即確定待測樣本的基礎(chǔ)熒光域值
同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2。同型對(duì)照就是使用同型抗體進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)待測標(biāo)本對(duì)抗體非特異性結(jié)合的水平。例如，使用的熒光抗體為FITC標(biāo)記、鼠IgG1亞類抗體，那么其同型抗體應(yīng)該為FITC標(biāo)記、鼠IgG1亞型同型抗體。
同型對(duì)照可以根據(jù)染色方法這樣設(shè)置；
1）對(duì)于直接免疫熒光染色標(biāo)本，建議選擇試劑公司提供的與抗體配套的同型抗體最為陰性對(duì)照
注意：同型對(duì)照要選擇與染色抗體相同劑量及濃度，同型對(duì)照要與選用的染色抗體廠家一致
BD 流式抗體的同型對(duì)照可在BD 官方網(wǎng)站查找，在相應(yīng)流式抗體介紹頁面下方即可看到BD 推薦使用同型對(duì)照
2）對(duì)于間接免疫熒光染色標(biāo)本，設(shè)置以同型抗體作為一抗再加熒光二抗的平行管作為陰性對(duì)照。若當(dāng)時(shí)無同型抗體，則至少需設(shè)置只加二抗、不加一抗作為陰性對(duì)照
由于有些細(xì)胞高表達(dá)Fc受體（FcR），如DC、B細(xì)胞等，能夠通過其FcR與特異性熒光抗體結(jié)合，造成其基礎(chǔ)熒光域值比較高，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。封閉抗體對(duì)照常用于檢測某些低表達(dá)分子、而該細(xì)胞高表達(dá)Fc受體的實(shí)驗(yàn)。封閉抗體一般為未標(biāo)記的羊IgG、鼠IgG。封閉抗體對(duì)照即用封閉抗體預(yù)先與待測細(xì)胞共孵育，以阻斷待測樣本對(duì)特異性熒光抗體的非特異性吸附作用，降低待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值。 陰性細(xì)胞對(duì)照即用已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陰性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用于確定抗體的特異性 正常血清對(duì)照多用于間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)中，在間接熒光標(biāo)記過程中，第二抗體多用熒光標(biāo)記多克隆抗體（如熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG、大鼠抗小鼠IgG等）。對(duì)于某些檢測的樣本，這些二抗與樣本非特異性結(jié)合比較高，可能造成其基礎(chǔ)熒光域值比較高，影響結(jié)果的精確性和靈敏度。為排除這部分干擾，可選用二抗來源動(dòng)物的正常血清或IgG封閉非特異性結(jié)合，降低其基礎(chǔ)熒光域值。操作步驟：先加一抗，再加正常血清或IgG，最后加熒光標(biāo)記的二抗 陽性對(duì)照即用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用于檢測抗體是否有問題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。如果陽性對(duì)照呈陰性或陽性減弱，提示抗體的滴度、特異性可能有問題，也可能是實(shí)驗(yàn)方法的問題，如試劑、操作不當(dāng)?shù)取?由于熒光光譜的重疊，對(duì)于多色分析樣本必須設(shè)置補(bǔ)償對(duì)照。補(bǔ)償對(duì)照主要用于多色分析時(shí)熒光光譜重疊的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。補(bǔ)償對(duì)照是將用于多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本反應(yīng)，一一進(jìn)行單色標(biāo)記，以測定熒光信號(hào)的重疊并作適當(dāng)調(diào)節(jié) 。
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