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CBA流式液相多重定量技術操作全解

發布日期：2015-10-19　　瀏覽次數：7220　　

CBA流式液相多重定量技術操作全解

CBA實驗流程

流式細胞儀Setup Bead操作流程

流式數據分析

實驗前準備

1、準備儀器、耗材

A.12X75mm的BD Falcon流式上樣管(Cat#352008)

B.CBA分析軟件:FCAP分析軟件或CBA Kit Analysis Software分析軟件

C.流式細胞儀：配有488nm激光器、可以檢測和區分576nm和670nm發射光的流式細胞儀，如BD FACSCalibur、BD FACSArray、BD LSR、BD LSRII、BD FACSAria和Coulter XL等流式細胞儀

D．流式細胞儀質控微球:在裝有BD Cell Quest或BD Cell Quest Pro軟件的流式細胞儀上，無APC通道的質控微球是CaliBRITE3 Beads (Cat#340486),有APC通道的質控微球是CaliBRITE3 Beads(Cat#340486)和BD CaliBRITE APC Beads(Cat#340487)；在裝有BD FACS Diva軟件的流式細胞儀運行CBA時，質控微球是Rainbow Beads(3.0~3.4um) 等;

在BD FACSarray流式細胞儀運行CBA時，質控微球是Daily QC Particles for FACS array等。

E．低速離心機和Votex

2、實驗前清洗流式細胞儀（必須）

以 BD FACSCalibur為例

1)打開 BD FACS Calibur流式細胞儀

2)斷開鞘液筒連接

3)旁路鞘液過濾器：鞘液過濾器上端的管路從 SALINE FILTER端口斷開，將鞘液管路（白色）取下，連接到 SALINE FILTER端口上

4)鞘液桶中裝1：10稀釋漂白劑1-2 L

5)儀器處于RUN狀態，流速為HI，Falcon樣本管中加入1：10稀釋漂白劑3mL，加在上樣針位置，清洗20-30分鐘

6)移去裝有1：10稀釋漂白劑的Falcon樣本管

7)使用加有蒸餾水的鞘液桶和Falcon樣本管，同樣方法清洗管路(重復第3-5步)

8)將裝有鞘液的原鞘液筒恢復原位，連接好鞘液過濾器，上樣針位置放盛有 1mL蒸餾水的樣本管

9)儀器選擇 Stand by模式

3、實驗前流式細胞儀質控

A．裝有BD Cell Quest或BD Cell Quest Pro軟件的流式細胞儀運行CBA時質控（必須獲取質控條件）詳情請參考《BD FACS Calibur中文培訓手冊》

1)取出CaliBRITE3 Beads(Cat#340486)。如果有APC通道的流式細胞儀，除了CaliBRITE3 Beads，還需要CaliBRITE APC Beads(Cat#340487)

2)取出兩根BD Falcon流式上樣管，分別標記上I、II，加1ml鞘液到管I，加3ml鞘液到管II。將瓶口垂直向下擠1滴Unlabeled Beads到管I，混勻。給II管依次加入Unlabeled-、FITC-、PE-、PerCP-Beads各1滴混勻。如果有APC通道，則管I同時加入Unlabeled Beads和APC-labeled

Beads各 1滴，管 11加入所有 Beads各 1滴，最好最后加容易粹滅的 PerCP。混勻，避光放置，準備上機。

3)在流式細胞儀上打開FACSComp軟件,出現SignIn視窗，單擊Accept,進入SetUp視窗。

4)在左邊Assay Selection下點擊LYSE/NOWASH模式。在中間CaliBRITE Beads Lot ID中根據CaliBRITE3 Beads試劑盒中每種Beads所對應的編碼輸入Lot ID，若有APC通道，除了3Beads的LotID，還需要根據CaliBRITE APC Beads試劑盒輸入對應的Lot ID。在最上面的Cytometer欄目下打開Preference出現一視窗，在視窗的左端拉到最下面一個圖標（CBA圖標），雙擊，出現一個視窗，勾上Create CBA模式，按確定。在SetUp視窗下的右下角單擊RUN，出現PMT視窗。

5)管I混勻，上機，按功能鍵RUN，流速設成HI，點擊Start。FACSComp先獲取5000個Beads，在單個Beads群的位置設門，開始自動調節PMT。如果有APC通道，FACSComp將自動檢測到APC通道并調節其電壓。FACSComp根據Target Value自動調節PMT到預期值。如果流速小于400個beads/秒或者PMT自動調節的時間大于75秒，FACSComp將變成手動調節，這時單擊Manual鍵，出現Target Value窗口，手動調節PMT，使SSC的值在TargetValue±5范圍內，使熒光通道的值在TargetValue±2范圍內。

6)管II混勻，上機，單擊start，FACSComp開始自動調節補償。如果如果流速小于400個beads/秒或者補償自動調節的時間大于75秒或補償的值超過50％時，FACSComp會進入手動調節，單擊Manual鍵，手動調節補償使各補償值在TargetValue±2范圍內。

7)補償完后自動進入靈敏度調試，單擊Start，開始調節靈敏度，調節完后，軟件計算出結果，并將所有結果在BD FLIES/INSTRUMENT SETTING里面以CalibFile.LNW形式自動保存（會取代以前的CalibFile LNW文件）,同時給出一份Summary Report。點擊Quit,退出FACSComp。

如果質控不能通過，則必須再次清洗儀器后質控。

B．裝有BD FACS Diva軟件的流式細胞儀運行CBA時質控

詳情請參考《BD FACS Aria用戶指南》

1）啟動儀器,選擇

“Edit>UserPreference”命令，在“General”頁面中，取消所有選項。在“Gates”頁面里，將間隔門和象限門都設為“No Color7(無色)”。

2）檢查儀器配置：選擇

“Instrument>Instrument Configuration”命令。出現“InstrumentConfiguration”對話框。如果當前的儀器配置是“FACS Aria Class”，則進入下一步。如果不是“FACS Aria Class”,在儀器配置列表中選擇“FACS Aria Class”,單擊“Set Configuration”鍵,單擊“OK”。

3）單擊工具欄上的相應工具圖標顯示“Browser”，“Instrument”，“Inspector”，“Worksheet”和“AcquisitionControl”窗口。選擇位于瀏覽器中的數據庫圖標，然后單擊“Folder”新建一個“Experiment”文件夾，命名，如Jena。選定Jena文件夾，然后在Jena下再新建一個子文件夾,命名為“QC”。

4）打開瀏覽器中的“群體模板”文件夾，右鍵單擊“QCTemplate”，然后選擇”Copy”命令,復制“QC Template”,粘貼至Jena\QC文件下，雙擊打開粘貼好的“QC”實驗。使用當天日期+QC”命名新“QC”實驗；使用當天日期命名其內的“Specimen”。

5）使用前搖勻RainbowBeads,取一根12×75mm樣品管中，加1ml的鞘液和2-3滴Rainbow Beads，混勻，避光準備上機。雙擊“BlueTemplate”（工作圖中有一個淺綠色頁有個圖形，用于觀察來自488nm波長激光參數的信號）。將“獲取指示”移至“BlueTube”旁。藍色激光信號最優化:樣品管裝入載樣端口,然后單擊“Acquisition Control”里的“Load”,樣本進樣倉,獲取程序自動啟動。將流速設置為1.0。調節FSC和SSCPMT，使FSC/SSC散點圖上P1門內的質控微球數值達到100×103左右。選擇“BlueTube”。單擊“Inspector”窗口內的“InstrumentSetting”，然后單擊“Parameter”。

6）調節藍色激光的面積因子：調節FITC光電倍增管電壓值，使得FITC-H的信號強度達到100×103左右。檢查FITC-A和FITC-H的信號強度（見圖），如果這兩種信號強度是相等的，則進入下一步。如果二者不相等，那么單擊在”Instrument”窗口中的”Laser”頁面調節面積因子，選定當前的數值，然后輸入一個新的數值，直到FITC-A和FITC-H的信號強度相等。為每一參數最優化其光電倍增管電壓值，使其信號強度達到100×

103左右。

7）確認獲取指示位于“BlueTube”，然后單擊“Record”。待“BlueTube”記錄完畢，該采集管圖標就變成綠色。該“BlueTube”目錄下出現與之相應的“Instrument Setting”文件。數據記錄完成后，單擊”Acquisition Control”窗口上的“Unload”鍵，取下樣品管。將每一熒光參數信號強度的平均值和變異系數記錄到質量控制記錄表上。

8）如需要，輕微調節最優化紅色激光的激光延遲時間設置。使用“RedTemplate”和參數，重復藍色激光信號調節步驟，最優化紅色激光。

9）紅色激光延遲時間設置：單擊“Laser”頁面，將“WindowExtention”調至“0”，可在最窄的時間窗內捕捉到脈沖變化，以“0.1”的數值間隔逐漸調節紅色激光延遲時間數值，使細胞群體的平均熒光信號強度達到最高值（典型設置模式如圖）。最優化每一熒光參數光電倍增管電壓值使其直方圖上強度達到100×103左右。將每一熒光參數信號強度的平均值和變異系數記錄到質量控制記錄表上。

10）紫色激光信號最優調節：重復“最優化紅色激光信號”步驟，并使用紫色激光的模板和參數。

11）再次進行質量控制實驗時，重復步驟1－2。打開“QC實驗”，右鍵單擊首個“Specimen”，選擇“DuplicatewithoutData”命令，三個“QCTube”文件同時出現在這一新的“Specimen”目錄下，使用當天日期重命名，雙擊“BlueTemplate”，顯示圖形，重復步驟5－10。

CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit操作指南（BD Cat.550749）

上機前準備

1、準備樣本

CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit的標準品的定量范圍是20-5000pg/ml，待測樣本為血漿、血清、培養上清、淚液、體液、鼻腔沖洗液等。

1）如果樣本是超低溫保存，則取出樣本，置冰上解凍。

2）如果樣本中待測樣本濃度超出定量范圍，則用Assay Diluent以1：2或1：10等比稀釋，稀釋后充分混勻。

3）確定待測樣本的數目

2、制備標準品（制作標準曲線）

1）重構標準品：取出1根流式上樣管，標記為1：1，倒入1管Human Th1/Th2 Cytokine Standard至1：1管中（標準球易粘在瓶蓋上，注意倒干凈）。加入2ml Assay Diluent，輕輕搖晃幾秒種，防止產生氣泡（用Tip很容易產生氣泡），放置室溫15分鐘，使標準品完全溶解。

2）等比稀釋標準品：取出9根流式上樣管，分別標記等比稀釋的倍數1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256和0，每管各加300μl Assay緩沖液。從1：1管取300μl完全溶解的標準品到1：2管，吹打混勻，換Tip頭，依此類推，直到1：256管為止，如下圖所示。每次加樣前必須充分混勻和換Tip頭。稀釋后標準品管(從1：1到0)的濃度(pg/ml)值依次是5000、2500、1250、625、312.5、156、80、40、20、0。稀釋好的標準品可4C保存12小時。

3、制備捕獲微球（80Tests，微球易沉積，充分混勻是關鍵）

A．待測樣本是細胞培養上清

1）確定上機樣本數目：待測樣本是N個，標準10個，總共上機樣本是（N＋10）個，保證每個樣本結合每種微球各10μl，所以，每種捕獲微球需要的總量是10(N+10)μl。比如，待測樣本是6個，總共上機樣本是16個，每種混合微球的總量是160μl。

2）加入捕獲微球（A1、A2、A3、A4、A5、A6）之前，A1到A6需要蝸旋充分混勻（關鍵）。

3）取一根流式上樣管，標記為Beads，從A1到A6，各取10(N+10)μl。蝸旋充分混勻。

B．待測樣本是血清和血漿樣本

1）重復細胞培養上清的步驟1-3

2）混合好的微球200g離心5分鐘，肉眼觀察可見微球沉積，如無沉積，再次離心。用Tips吸去上清。

3）加60(N+10)μl血清Enhancement緩沖液，蝸旋充分混勻，室溫避光孵育30分鐘。

4、制備上機樣本（如下圖）

1)取出（N+10）根Falcon流式上樣管，分別標記N個待測樣本的名字和10個標準品的比例。

2)加入制備好的混合微球：混勻混合微球，每管分別各加50μl捕獲微球混合物。

3)加入檢測抗體：各管分別加入50μl PE標記的Detection抗體（B）（80Tests）。

4)給10個標準品管各加入50μl對應的稀釋好的標準品,給N個待測樣本管各加50μl待測樣本。

5)蝸旋充分混勻，在室溫避光孵育3小時（0管無需孵育）。進入步驟四中的CBA上機條件設置。

6)每管各加1mlwashbuffer，200g離心5分鐘，如無沉積，再次離心，小心用TIP吸去上清，最后留大約150μl。如有必要，可以重復該步驟。

7)分別給每個試管加300μlwashbuffer(F)，充分混勻，準備上機。樣本必須當天分析，否則很容易增加背景和減弱熒光，標準品上機樣本。

CBA流式上機條件設置和樣本獲取

注意：所有上機過程中，獲取微球初始需平衡6-7秒再看結果，調節參數后需在Acquire Control窗口反復使用Pause和Restart，以重置得到最新數值。獲取上機樣本時，注意隨時觀察平行微球帶的變化，注意第一個門是否圈住微球群。

3色Calibur流式細胞儀

A、3色Calibur流式細胞儀CBA上機條件設置（Set up試劑：10Tests）

1）取出3根Falcon流式上機試管，分別標記A、B、C。蝸旋混勻Cytometer Setup Beads微球，A、B、C各管加50μl。

2）在B管加50μlFITC Positive Control抗體，C管加50μl PE Positive抗體。A、B、C管置

室溫避光保存30分鐘。

3）加450μl Wash Buffer到A管，加400μl到B、C管，每管總共500μl。

4）安裝CBA Kit Analysis Software，打開BD CBA Instrument Setup Template。下拉Acquire菜單中選擇Connect to Cytometer，出現Acquisition Control對話框，選擇Setup。下拉cytometer菜單中打開Detectors/Amps（電壓）、Threshold（閾值）、Compensation（補償）和Status（狀態）4個窗口。

5）下拉cytometer菜單，單擊Instrument Setting，出現Instrument Setting對話框，單擊Open,選擇CBA質控3色FACSComp生成的CalibFile.LNW文件（在FACS tation/BD File/Instrument Setting路徑下），在Instrument Setting對話框同時單擊Set和Done。

6）在電壓窗口中調節SSC和FSC電壓Mode成LOG。在閾值窗口中點擊FSC，調節其域值到650。

7）上試管A，按流式儀上的LOW，在Acquisition Control對話框點擊Aquire。如未見聚集的微球群，則在電壓窗口中調節SSC電壓值，使其在現已的基礎上再減去100。見Figure3a,移動門R1圈住微球群，觀察到Figure3b出現明暗2群微球帶。若未觀察到，則需要繼續移動R1門。若R1門下見雜質多，則在閾值窗口中同時選擇FSC和SSC，調高SSC域值至雜質減少。按流式儀上的Medium。見Figure3b,在電壓窗口調節FL3電壓值，使R2門內微球群的在FL3上均值大約等于5000（不要移動R2門）。若需要，移動R3圈住FL3上微球。調節FL1電壓使FL1的均值在2－2.5之間。見Figure3c,調節FL2電壓值使FL2均值在2－2.5之間。

8）上試管B,確認R1圈住微球群。見Figure3c,移動R5圈住亮微球群（勿移動R4），調節FL2-％FL1補償,使R4和R5在FL2上均值相等。若在R5未見微球群，則可能是補償過度，調小FL2-％FL1值。

9）上試管C，確認R1圈住微球群。見Figure3d,移動R7圈住亮微球落（勿移動R6），調節FL1-％RL2補償，使R6和R7在FL1上均值相等。見Figure3e，移動R9圈住亮微球落在里面，調節FL3-％FL2，使R8和R9在均值相等。如需要，調節FL2-％FL3為0.1。

10）下拉Cytometer菜單，單擊Instrument Setting，出現對Instrument Setting話框，單擊Save，并以“日期＋CBA Setup”命名保存CBA Setup條件。

11）上0管，確認R1圈住微球群，觀察Figure3b、3c中，出現6條平行微球帶，如微球帶不平行，則重復CBA上機調節設置直至平行為止。退出CBA Setup模板。

B．3色BD FACS Calibur流式細胞儀CBA上機獲取樣本

1）打開BD CBA Mouse Isotype Acquire Tempalte，下拉Acquire菜單中單擊Connectto Cytometer。在Acquisition Control窗口中，選擇Setup。下拉cytometer菜單，單擊Instrument Setting，在對話框中單擊Open,選擇A步驟中保存的CBA Setup條件，同時單擊set和done。

2）下拉acquire菜單，單擊Acquisition&Storage，出現Acquisition&Storage窗口。在Collection Criteria中，將10000改稱1800（保證每種微球收集大約300個），All改成R1。在Storage Gate中選擇默認設置：All.。Resolution值調節到1024。單擊OK。

3）下拉Acquire菜單中打開Parmeter description窗口，點擊Folder,選擇流式上機結果保存路徑，在此路徑下Create一個新文件夾，以“日期＋CBA”命名，再Create2個子文件夾，分別命名為Sample和Standard，選擇Standard文件夾，單擊OK。單擊FILE，出現文件名編輯窗口，在customprefix中命名文件（文件名前兩位必須是字母）。

4）樣本上機之前必須蝸旋3-5秒，混勻。上0管，按流式儀上LOW，在acquisition control對話框單擊Acauire，見Figure4,移動R1圈住微球群。按流式儀上HIGH，取消acquisition control對話框中Setup，單擊Acquire采集至結束，按照濃度從低到高依次上1：256管至1：1管采集標準品樣本。如果樣本濃度增高，水平微球微帶在FL2上向均值大的方向移動。

5）參照第3步打開Parmeter description對話框，單擊Folder，選擇Sample文件夾，依次上待測樣本管。