分離淋巴細胞（或裂解紅細胞）--細胞刺激---阻斷Fc受體--細胞表面染色--固定--破膜--胞內染色1.獲取實驗的組織（脾臟、淋巴結、胸腺、骨髓），然后分離淋巴細胞，制備單細胞溶液，buffer可用Stain Buffer(FBS)
2.如果是體外刺激培養的細胞，可直接用Stain Buffer(FBS)重懸刺激的細胞
3.加Stain Buffer(FBS)到離心管至10ml，350g離心5min。
如果做的組織是脾臟，需要裂解紅細胞。首先把10X的紅細胞裂解液Lysing Buffer用蒸餾水配制成1X工作液。后續操作可參考Lysing Buffer說明書。5.細胞計數后，加Stain Buffer(FBS)調整細胞數濃度在5-10x106cells/ml，以每管100ul的細胞懸液加到流式管中，這樣細胞數濃度接近于5-10x105cells/ml。6.取出6孔板，做好標記（未刺激孔、刺激孔），每孔加入1ml淋巴細胞懸液,再分別加入
1ml RPMI1640（10%FBS），混勻，避免產生氣泡。
7.刺激孔分別加入刺激劑和阻斷劑，用槍吹打混勻,盡量避免產生氣泡。9.刺激5小時后，收細胞，同時用1ml RPMI1640沖洗細胞培養板，一起收集到離心管中，350g離心5min，棄上清。10.分別加入2ml Stain Buffer(FBS)中，350g離心5min。
11.棄上清，分別重懸細胞到1ml Stain Buffer(FBS)/管。
Mouse BD FcBlock? 阻斷非特異的受體。13.加入適量的CD3、4、8等表面標記抗體到已準備好的細胞懸液里。冰上or室溫,避光孵育15-20min.14.加入至少2ml的Stain Buffer(FBS)洗2次。350g離心5min，棄上清。
15.加入0.5ml的Stain Buffer(FBS)重懸細胞。
16.可根據選用的固定劑、破膜劑按照試劑規范protocal進行操作17.加100ul Perm/Wash?buffer重懸固定破膜后的細胞，加入適量的熒光標記抗體IL-4、IFN-γ、IL-17A及同型對照，冰上or室溫避光20min18.用1ml Perm/Wash?buffer把細胞洗兩遍。350g離心5min，棄上清。
19.用0.5ml Stain Buffer(FBS)重懸固定染色后的細胞，上機檢測分析。
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