簡介
        免疫組化( IHC) 常用于確認腫瘤或其他組織癌變的形態特征。 在保持原組織成分、 細胞特征以及結構的情況下， IHC 利用抗體檢測和分析該組織細胞中的蛋白質表達。 化學固定常用中性緩沖福爾馬林( neutral buffered formalin, NBF) 或甲醛將細胞內以及細胞間分子相互作用固定在原位。 組織樣品在被切成切片以及裝入載玻片以供分析之前， 可在固體石蠟中包埋或在低溫溶液中進行冷凍保存。 針對不同的樣品或檢測靶標， 有不同的組織收集、 保存和固定方法。
        IHC 通過結合特異性抗體來識別生物樣品中蛋白質的存在以及表達方式。 抗體與其靶點蛋白質表位的精確結合可檢測蛋白質中具有高度特異性的氨基酸序列。 抗體也可檢測蛋白質的特異翻譯后修飾( post–translational modifi cations, PTM) 。磷酸化特異性抗體已用于確定特定信號通路分子以及研究在不同的生物學背景下磷酸化事件中的變化。 近來， 人們研發出了用于檢測其他PTMs 的特異性抗體， 這使得研究人員可以監控蛋白質乙酰化、 甲基化或泛素化狀態的變化。
        在 Cell Signaling Technology (CST ) 專門從事IHC 的科學家檢測了大量的抗體，只推薦了其中最適合應用于IHC 的抗體。 我們的科學家對大量的抗原修復和免疫染色方法進行了檢測，確定了IHC 中各抗體的最佳使用條件。 此外， 科學家還研制了IHC 配套試劑， 以加強抗原的檢測并改善IHC 操作的有效性。 
        在此， 我們將重點講述IHC 操作流程中的關鍵步驟， 并提供數據以支持及解釋我們在實驗過程中所提的建議。 此外， 我們也將討論在IHC 實驗過程中， 使用經嚴格驗證抗體的至關重要性。最后，本指南列出了CST 科學家內部常用且最適用于與抗體配套使用的IHC 試劑。



經嚴格驗證的抗體的重要性
        一抗在任何IHC 檢測中都至關重要， 對數據質量存在直接影響。 質量較差的一抗可對實驗結果造成干擾， 導致結果無法解釋或存在誤解。 某一抗體的單一組織樣品陽性染色結果不足以證實其在IHC 中的可用性。 抗體應通過嚴格的驗證過程， 以確保其可精確地檢測到靶點。

IHC 驗證過程包括：
  ? 運用免疫印跡分析評估交叉反應條帶。
  ? 運用已知靶點蛋白表達水平的細胞株制作的石蠟包埋細胞團進行特異性檢測， 包括通過磷酸化、乙酰化、剪切等處理方法驗證修飾特異性。
  ?  通過磷酸酶處理方法驗證磷酸化特異性。
  ?  利用阻斷肽驗證特異性，并排除Fc介導的結合、生物素背景以及其他非特異性染色。
  ?  對相應的患癌小鼠模型進行特異性檢測。
  ? 對已知靶點蛋白表達水平的細胞株產生的異種移植物進行特異性檢測， 包括對應藥物治療后靶點表達的調節。
  ? 利用人類組織芯片對各種組織類型進行抗體功能檢測。
  ?  在適當的情況下，對新鮮的冷凍組織進行抗體功能檢測。

掌控您的IHC檢測
        將抗體添加到組織中并獲取信號是一件很容易的事情。 但是， 所獲得的信號是特異的嗎？在任何實驗中， 我們都應考慮包含適當的對照。 陽性和陰性對照可使您進一步確定您的抗體檢測到預定的靶點。在檢測組織之前， 可利用各種細胞株和處理條件在細胞水平上評估抗體性能。 例如， 利用陽性表達和陰性表達的細胞株評估總蛋白抗體的特異性。 此外， 由已知可引發信號變化的生物或化學調節劑處理細胞， 以檢測修飾特異性， 如磷酰化、 乙酰化、 剪切等。 經磷酸酶處理后， 可對磷酸化抗體做進一步評估。 此外， 同型對照抗體有助于排除因Fc受體結合或其他蛋白質與蛋白質相互作用引起的一抗的非特異性染色； 同型對照抗體應與檢測抗體具有相同的免疫球蛋白類型。

關鍵步驟：
載玻片制備
        請注意：查閱產品說明書以確定產品是否經過驗證可用于石蠟包埋(IHC–P) 或冷凍(IHC–F)樣品。 鑒于大多數源自CST 的IHC 適用抗體被用于石蠟包埋樣品，所以我們在此將主要對IHC–P 操作流程提出建議。操作步驟的變動將會被酌情指出。
IHC-P：石蠟包埋細胞團和組織
        免疫染色前， 需收集細胞團樣品并將其固定于10%的中性緩沖福爾馬林(NBF) 中， 以維持細胞形態和抗原表位。 利用自動處理機對樣品進行脫水， 并將樣品浸潤于固體石蠟。 將浸潤石蠟的樣品置于裝有少量液態石蠟的模子中， 將其冷卻。 利用切片機獲取厚度為4–6 μ m 的樣品， 并將其置于有助于樣品粘附的帶正電荷的載玻片上。關于如何制備貼壁和懸浮細胞的石蠟包埋細胞涂片的所有細節，請參見IHC實驗成功指南第 12  頁的《細胞涂片制備流程》。對于組織樣本而言，IHC 抗體對收集、固定和石蠟包埋步驟的要求因具體組織類型而異。
IHC-F：冷凍組織
        切片前， 應將冷凍組織儲存于–80 ℃的溫度下，然后包埋入OCT包埋劑。 準備染色時，切片前將組織置于–20 ℃環境中15分鐘以平衡組織成分。利用切片機獲取厚度為6–8 μ m 的組織， 并將其置于帶正電荷的載玻片上。為進一步幫助樣品粘附于載玻片上，我們建議在固定前，將載玻片在室溫下風干幾分鐘，以清除所有的殘余水分。查閱產品說明書中所推薦的最佳固定劑和固定條件。
載玻片存儲
以下內容僅適用于石蠟包埋樣品。
       使用最新制備的載玻片以獲得最佳結果。 長時間存儲可能導致載玻片樣品失去抗原性。 該過程會有所不同， 視靶點蛋白質而定。 因為各蛋白質的載玻片存儲對染色的影響不明，所以在使用之前，制備新載玻片是最佳方法。如果載玻片必須存儲，則將其存儲于4℃的無烘烤環境中。
脫蠟/復水
以下內容僅適用于石蠟包埋樣品。
        為使抗體結合及染色， 需將石蠟完全清除。 這需要經過一系列的二甲苯/ 乙醇/ 水清洗， 以清除石蠟， 并使組織復水以便于之后的抗體結合。 石蠟清除不徹底可導致染色出現斑點及背景染色不均勻。 如發生該情況， 則需利用新鮮的二甲苯制備新切片以重復實驗。 脫蠟和復水步驟完成
后，則需在接下來的操作流程中避免載玻片變干。
抗原修復
以下內容僅適用于石蠟包埋樣品。
       因為固定時形成的交聯可通過阻止抗體與抗原接觸來防止抗體結合； 因此， 需通過抗原修復（ 也稱為抗原暴露或抗原表位修復） 的過程來逆轉交聯。抗原修復可通過熱誘導的方法（heat–induced epitope retrieval, HIER ）或者酶解達到。產品說明書中將明確闡述用于CST? 抗體的推薦
方法。