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ChIP實(shí)驗(yàn)原理及步驟
發(fā)布日期：2012-12-10 瀏覽次數(shù)：9462
ChIP實(shí)驗(yàn)原理及步驟
真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitation assay, ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組DNA結(jié)合的狀況。其應(yīng)用范圍已經(jīng)從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用，發(fā)展到研究目的蛋白與整個基因組的未知序列的相互作用；從研究一個目的蛋白與DNA的相互作用，發(fā)展到研究兩個蛋白與DNA共同結(jié)合的相互作用；從研究啟動子區(qū)域的組蛋白的修飾，發(fā)展到研究結(jié)合在DNA序列上的蛋白復(fù)合物。
ChIP的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后用所研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合體，從而特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA 片段。染色質(zhì)免疫共沉淀是理解染色體的一種革命性工具，使研究者了解染色質(zhì)及其相結(jié)合的調(diào)控因子之間的時空動態(tài)相互作用。
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| ChIP原理圖 |
細(xì)胞固定—染色質(zhì)斷裂—染色質(zhì)免疫沉淀—交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化—DNA的鑒定
- 1.細(xì)胞的甲醛固定
- 交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1%，而交聯(lián)時間需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。交聯(lián)時間如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP 結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被甘氨酸終止。通常的交聯(lián)條件為室溫10 min。
- 2.染色質(zhì)斷裂
- 通常采用超聲波斷裂染色質(zhì)。超聲波使用機(jī)械力把染色質(zhì)斷裂成200-1000bp左右的片段，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP 的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。
- Micrococcal Nuclease也可以將染色質(zhì)切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一（圖1）。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經(jīng)常采用沒經(jīng)過甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因?yàn)镹-ChIP沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。
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圖1.染色質(zhì)斷裂方法比較 - 3.染色質(zhì)免疫沉淀
- 抗體的量要進(jìn)行優(yōu)化，防止非特異的結(jié)合。用Protein-A/G Sepharose 回收免疫沉淀復(fù)合體，經(jīng)過洗滌除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)。
- 4.65℃解交聯(lián)蛋白質(zhì)和DNA 復(fù)合物，消化蛋白質(zhì)，純化富集的DNA。
- 在免疫沉淀復(fù)合體中加入不含DNase 的RNase 和蛋白酶K，65℃保溫6h 以上，使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。交聯(lián)逆轉(zhuǎn)后純化回收DNA。
- 5.DNA鑒定
- 最常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區(qū)域的序列具有多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細(xì)胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同。而且啟動子區(qū)域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應(yīng)調(diào)整。有條件可設(shè)計(jì)不止一對引物來反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。