常見問題分類及解答

常見問題分類

1. 細胞密度太高或者匯合太快

2. 細胞匯合太慢

3. 細胞未能遷移至基底室

4. 細胞還未接受刺激就已經遷移至基底室

5. 細胞單層受到破壞

6. 顯微鏡下觀察不到細胞

7. 上室出現漏液或充滿培養基，膜上有洞

8. 細胞形態不正常

9. 實驗所需培養基或者裂解液不充足

10. 培養基溢出

11. 染色時膜被溶解

12. 染色時密封失敗或者泄漏

13. 培養基在小室之間流串

14. 細胞貼壁不好

15. 細胞生長不好

16. 信號超過檢測系統的敏感范圍

17. 沒有信號或者信號比預期的弱

18. 未預期的實驗結果

19. 遷移實驗中，對照組和測試組之間沒有差別

20. 生物污染

詳細解答列表

1. 細胞過度匯合或者匯合速率過快

* 細胞培養時間過長。重新開始實驗，縮短培養時間或者降低細胞起始鋪板密度。

* 細胞起始密度過高。重新開始實驗，降低細胞起始鋪板密度。

* 細胞傳代次數太多。隨著衰老和代數增加，細胞形態會發生一些變化。有可能這次實驗的細胞比之前的代數靠前或者靠后，造成實驗結果不穩定。復蘇代數靠前的細胞重新開始實驗。

2. 細胞匯合太慢

* 細胞培養時間不夠。繼續培養細胞至更長時間。

* 細胞起始密度太低。繼續培養細胞或者以更高的細胞密度重新開始實驗。

* 細胞傳代次數太多。隨著衰老和代數增加，細胞形態會發生一些變化。復蘇代數靠前的細胞重新開始實驗。

* 培養基不適合這株細胞。確保使用正確的培養基，并且加入所有的添加物。以新鮮培養基重新開始實驗。

3. 細胞未能遷移至基底室

* 選擇的膜孔徑偏小。確保選擇合適孔徑的膜，可以嘗試更大孔徑的膜。

* ECM鋪得太多。過多的ECM可能會堵住孔，嘗試使用少量ECM或者其它種類的ECM。

* 對細胞的刺激沒有促遷移作用。確保采用適合該細胞遷移的刺激以及正確的濃度。設置陰性和陽性對照組。

* 細胞傳代次數太多。隨著衰老和代數增加，細胞形態會發生一些變化。復蘇代數靠前的細胞重新開始實驗。

* 實驗所用的細胞系不正確。確保使用正確的細胞系以及正確的刺激濃度。設置陰性和陽性對照組。

4. 細胞還未接受刺激就已經遷移至基底室

* 膜的孔徑太大。重新開始實驗，使用孔徑稍小的膜。

* 細胞種錯了位置。細胞應該種在上室。

* 膜上可能有洞。補加或者移走培養基時需要小心，避免戳破膜。很多 Millicell裝置都有頂端輔助區域，以方便移液槍操作。

5. 細胞單層受到破壞

* 更換培養基時不小心碰觸細胞。補加或者移走培養基時需要小心，特別是在上室操作時，避免戳破膜。許多 Millicell裝置都有頂端輔助區域，以方便移液槍操作。

* 加入細胞和培養基的順序有誤。不要在剛種下的細胞上加培養基。采取先按照某一濃度混勻細胞再接種或者先加培養基再種細胞的方式。

* 培養基高度內外不平。上室里面的培養基和基底室的應該保持相同高度。查看說明書，參照每部分區域的推薦體積。

6. 顯微鏡下觀察不到細胞

* 膜的類型不適合顯微鏡觀察。不是所有膜的材質或孔徑大小都適合于顯微鏡觀察。查看說明書以找到推薦合適的膜。

7. 上室出現漏液或充滿培養基

* 膜上可能有洞。補加或者移走培養基時需要小心，特別是在上室操作時，避免戳破膜。許多 Millicell裝置都有頂端輔助區域，以方便使用移液槍更換培養基。

8. 細胞形態不正常

* 細胞可能需要不同類型的膜（例如， PET膜替代聚碳酸酯膜）。考慮所使用的膜是否最適合該細胞。

9. 實驗所需培養基或者裂解液不充足

* 實驗所選裝置的孔太小。選擇孔數少一些的板（例如從96孔板轉移至24或者6孔板）或者將細胞從孔中轉移出來，另作所需的處理。

10. 培養基溢出

* 上室或者基底室的培養基太多。查看說明書，參照每部分區域的推薦體積。

11. 染色時膜被溶解

* 染色液的溶劑與膜的材質不相容。例如，甲苯溶劑與聚碳酸酯膜不相容。

12. 染色時密封失敗或者泄漏

* 染色液的溶劑與膜的材質不相容。例如，甲苯溶劑與聚碳酸酯膜不相容。

13. 培養基在小室之間流串

* 上室培養基的高度與基底室的不平。查看說明書，參照每部分區域的推薦體積。

14. 細胞貼壁不好

* 實驗所用的細胞可能需要不同的培養基或者添加物。根據ATCC建議，再次確認細胞所需要的培養基成分和所需添加物。

* 細胞可能需要ECM。種細胞前，鋪一層合適的ECM。

* 細胞可能需要另一種ECM。如果細胞貼壁需要ECM，確保使用的ECM是最合適的，而且濃度正確。

* 起始細胞密度不正確。嘗試增大或者降低起始細胞密度

* ECM有可能被培養基稀釋。在種細胞和加培養基之前，先鋪ECM細胞適合在其他類型的膜上貼壁（例如聚碳酸酯膜或者PET膜）。考慮所使用的膜是否最適合該細胞。

* 基底室培養基過多導致培養基流入上室。查看說明書，參照每部分區域的推薦體積。

15. 細胞生長不好

* 培養時間不充分。繼續培養。

* 起始細胞密度不正確。提高起始密度，重新開始。

* 細胞培養基或者添加物不正確。根據ATCC建議，再次確認培養基成分和所需添加物。

* 培養基太多或者太少，或者體積不足以覆蓋整個表面。查看說明書，參照每部分區域的推薦體積。

* 細胞傳代次數過多。復蘇代數靠前的細胞，重新開始實驗。

* 細胞生長可能需要ECM。種細胞前，鋪一層合適的ECM。

16. 信號超過檢測系統的敏感范圍

* 樣品濃度太高以至于不能精確檢測。使用小體積；稀釋樣品；使用更小孔的板（例如從24孔板轉移至96孔板）

* 檢測波長不正確。再次確認檢測試劑的激發光和發射光。

* 背景太高。降低檢測抗體的濃度；降低孵育時間；增加漂洗次數。

* 細胞需要其他種類的ECM。如果細胞需要ECM，確保使用的ECM種類和濃度都是最合適的。

17. 沒有信號或者信號比預期的弱

* 激發光或者發射光不正確。再次確認檢測成分的激發光和發射光。

* 檢測試劑的濃度太低。增加檢測試劑的濃度。

* 檢測試劑的孵育時間不夠。延長孵育時間。

* 熒光檢測試劑儲存或者反應時曝光了。避免熒光試劑曝于光下以防止光解作用。

* 細胞數量不夠或者不在合適的實驗狀態。確保細胞足夠，并且狀態適合實驗。

18. 實驗結果與預期不符

* 刺激加錯孔了。再次確認添加順序和刺激的位置。

* 刺激加入基底室而不是上室細胞（反之亦然）。檢查對照組是否正常。

* 對照組不充分，干擾實驗結果。設置足夠的對照組，以便更合理地詮釋結果。

* 刺激方法不正確。再次確認使用的刺激方法是正確的，并且適合該細胞。

* 刺激的體積或者濃度不正確。再次確認刺激濃度，如果有必要，做濃度曲線。

* 細胞在更換培養基時被吸走。更換培養基時，采用頂端輔助區域。

* 培養基沒有得到有效更換。培養在板上的細胞培養基更換要比在dish或者flask里的更頻繁，也要依照細胞密度而定。

19. 遷移實驗中，對照組和測試組之間沒有差別

* 細胞傳代過多。復蘇代數靠前的細胞，重新開始實驗。

* 移去培養基的順序有誤（基底室和上室）。使用合適的對照，檢查添加/替換的順序是否會影響實驗結果。

* 使用的裝置有誤。確定使用合適的板。檢查對照組是否正常。

* 小室膜的上層擦拭不充分。一些實驗只需要觀察基底面的細胞，但是兩面的細胞會被染上色并檢測到，所以要擦去上層。

20. 生物污染

* 包裝破壞被污染。確保使用前包裝完好，在無菌條件下打開密封。

* 非無菌操作。練習正確的無菌細胞培養技術。

* 培養基污染。使用前無菌過濾所有的培養基。使用帶有酚紅的培養基以通過顏色變化監測早期污染。

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