距估算約有10%的細胞蛋白質會發生磷酸化共價修飾。蛋白質磷酸化修飾是細胞的一種重要的信號調節機制，調節著細胞生長、增殖、泛素 （ubiquitin）介導的蛋白降解等過程。研究蛋白質磷酸化，Western Blotting是一種常用的方法，但與一般的Western Blotting相比，磷酸化特異性的Western Blotting難度要大很多，經常會遇到假陰性結果或背景偏高或缺少合適的磷酸化抗體等問題，這里，我們將和大家分享來自默克密理博提高磷酸化蛋白檢測 效果的一些實驗設計和實驗技巧。

在以前的科研里，沒有抗磷酸化抗體，蛋白質和激酶的磷酸化只能通過非常危險的并且費時的放射性實驗來檢測。現在利用抗磷酸化抗體，則可以通過 Western Blotting或其它免疫學方法輕松地檢測到磷酸化信號。常規的檢測方法包括：用抗目標蛋白的磷酸化特異性抗體在Western Blotting上檢測內源或外源表達的特定蛋白的磷酸化的發生；通用型的抗磷酸化抗體也常用于檢測在不同處理的條件下，細胞內總的磷酸化水平的變化情 況，作為許多細胞生物現象的一個重要指標。

有些時候蛋白磷酸化的Western Blotting檢測結果不好，可能是由于目標蛋白的表達量太低或目標蛋白磷酸化的水平不高導致。

如果目標蛋白的含量較低，可以利用免疫沉淀（IP）的方法先富集目標蛋白，再檢測目標蛋白的磷酸化水平。

目標蛋白磷酸化水平不夠高的情況，發生在酪氨酸位點的磷酸化尤為常見。酪氨酸磷酸化是細胞信號轉導和酶活性調控的一種主要方式，但在細胞的所有磷酸 化修飾中所占的比例卻非常低，大約每100次蛋白質的磷酸化修飾中僅有1次酪氨酸基團的修飾，與絲氨酸和蘇氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估計要 低2000倍。然而正是由于細胞中酪氨酸磷酸化的水平相當低，才能保證細胞在內外信號的刺激下，作出靈敏的反應，所以研究酪氨酸的磷酸化對于細胞信號調控 的研究具有極為重要的意義，識別發生酪氨酸磷酸化的蛋白質及鑒定這些酪氨酸位點能幫助揭示藥物的作用位點。

針 對目標蛋白磷酸化水平不夠高的情況，可以先把細胞內總的磷酸化蛋白進行富集，再把富集的組分上樣跑膠檢測。推薦采用專門針對Western Blotting的ProteoExtract?磷酸化蛋白富集試劑盒。如果是酪氨酸位點的磷酸化，也可以使用酪氨酸磷酸化的通用型抗體4G10偶聯的磁 珠或瓊脂糖珠子來特異性富集酪氨酸磷酸化蛋白質，把細胞內大量的絲氨酸、蘇氨酸磷酸化蛋白質和其它的蛋白質分離開來。
我們都知道如果需要檢測某一個目標蛋白的某一特定位點的磷酸化狀態，可以選用該蛋白質特定位點的磷酸化特異性抗體。但有很多時候，由于我們研究的是新的磷 酸化位點，或者市場上的磷酸化抗體效果不夠好，我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家已有制備磷酸化抗體的經驗，就會知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的 制備更加困難，而且浪費大量的寶貴時間。現在國外的科學家發現，結合使用通用型的磷酸化抗體，只要巧妙的設計實驗，也可以達到同樣的檢測目的。

以Yuan的文章為例，他們需要檢測BCR-ABL的磷酸化，但他們沒有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠 子來免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通過Western-Blotting和4G10通用型磷酸化抗體（pan- phosphotyrosine）來鑒定BCR-ABL蛋白的酪氨酸特異性磷酸化水平。

另外一組以Clemens為首的科學家，則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了與Dock相互作用的DACK和DSH3PX1蛋白，再用4G10 酪氨酸磷酸化抗體來檢測DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通過區分這些蛋白的分子量大小，來確認相應的磷酸化條帶的蛋白身份。

還有一些實驗是用Western Blotting來驗證一組磷酸化的多肽或蛋白的存在，這時候也需要使用通用型磷酸化抗體。對于這種實驗目的，需要選用的磷酸化抗體具有廣泛的識別范圍、同時又有很好的磷酸化特異性（例如4G10抗體），才不會導致假陰性結果的產生。

Liu的研究為例，他們就對比使用了通用型的磷酸化抗體4G10和PY20，利用Western Blotting來驗證不同抗體通過多肽芯片篩選出的磷酸化多肽結果。他們的實驗室是這樣設計的，首先利用磷酸化酪氨酸的多肽芯片（phospho- tyrosine peptide array）來篩選與SH2結構域結合的磷酸化多肽序列，然后對這些合成的多肽序列進行Western Blotting驗證，利用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10和PY20檢測其磷酸化水平。他們發現不同的抗體具有很不一樣的識別特異性，如pTyr- Pro 序列能被某些SH2結構域結合，而不被4G10和PY20識別。但就總體而言，通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體可以識別絕大多數的SH2結構域結合的磷酸化多 肽，特別是4G10抗體比PY20抗體能識別更多的磷酸化酪氨酸多肽。

與做普通的Western Blotting相比，磷酸化Western Blotting還有一些小技巧：

首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，會被磷酸酶去磷酸化，所以在樣品制備和整個免疫檢測過程中，需要抑制或避免細胞內源性和外源性的磷酸酶的干擾。

針對細胞內源性的磷酸酶，我們在樣品制備時，需要在細胞裂解液中加入足量的并且是新鮮的磷酸酶抑制劑（推薦PhosphoSafe 系列）。
對于外源性的磷酸酶，這主要是由實驗過程中的其它試劑帶入的，尤其是封閉劑。針對磷酸化檢測不能使用粗制蛋白作為封閉劑，以避免粗制蛋白里的磷酸酶的去磷 酸化作用，或其中可能含有的磷酸化蛋白造成的非特異性背景。因此，大家需要盡量使用專門為磷酸化檢測設計的封閉劑（例如Bl?k-PO）。有實驗表明，在 封閉劑中加入磷酸酶抑制劑能提高磷酸化特異性免疫檢測的信號(Sharma and Carew, 2002)。Bl?k-PO里就含有磷酸酶抑制劑，能保證膜上蛋白磷酸化狀態的完整。

除了封閉劑以外，樣品中或其它試劑中帶的細菌也會分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blotting的另一個關鍵是要盡量使用清潔的新鮮的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝膠，并且最好在樣品制備完就立刻上樣，當天完成SDS-PAGE和 Western Blotting 檢測。如果要使用同一張膜進行總蛋白的檢測，就需要先做磷酸化的檢測再做總蛋白的檢測，以盡量避免磷酸化信號的丟失，這點非常重要。

除了磷酸化的Western Blotting以外，目前關于磷酸化的研究還有一些其它的方法，如發現新的磷酸化位點的磷酸化蛋白質組學研究，還有使蛋白質發生磷酸化的激酶活性分析，請關注默克密理博不斷推出的磷酸化檢測新方法。

參考文獻：

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6. Petersen J & Hagan LM. Polo kinase links the stress pathway to cell cycle control and tip growth in fission yeast. Nature (2005)
7. Yuan H et.al. BCR-ABL gene expression is required for its mutations in a novel KCL-22 cell culture model for acquired resistance of chronic myelogenous leukemia. JBC (2010)

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轉載自：默克密理博蛋白研究工具超市