實(shí)驗(yàn)中需要加多少抑制劑？ 

抑制劑的使用量受多種因素影響，包括抑制對(duì)象的可接觸性，細(xì)胞通透性，孵育時(shí)間，細(xì)胞種類(lèi)等等。我們建議通過(guò)檢索文獻(xiàn)確定使用抑制劑的起始濃度。如果有報(bào)道的Ki值或IC50值，可以采用其5-10倍的量開(kāi)始嘗試以達(dá)到抑制酶活性的最佳效果。如果抑制劑的Ki值或IC50值未知，則需要在更廣泛的范圍嘗試抑制劑的使用濃度，并采用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)計(jì)算Ki值。采用高濃度抑制劑而沒(méi)有抑制效果，甚至得到相反的結(jié)果等情況并不罕見(jiàn)。最好設(shè)立溶解抑制劑所采用的溶劑作為對(duì)照，以排除溶劑的非特異性影響。

EC50，ED50，Ki，IC50，Kd和pIC50各指什么？它們有什么區(qū)別？ 

藥理和生化研究中，以下一些術(shù)語(yǔ)常常被用來(lái)描述藥物或抑制劑的功效；有時(shí)如果研究者沒(méi)有弄清原文獻(xiàn)作者使用的術(shù)語(yǔ)的確切含義，在重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)產(chǎn)生困擾。

EC50值：藥物達(dá)到最大臨床功效 (有時(shí)是抑制或刺激效果)50%時(shí)的濃度。這是一個(gè)藥用術(shù)語(yǔ)。

ED50值：50%的個(gè)體表現(xiàn)特定藥效時(shí)藥物的有效劑量（而非濃度）。

IC50值:達(dá)到 50%抑制效果時(shí)抑制劑的濃度。

Ki值： 檢測(cè)到 50%抑制效果時(shí)的抑制劑的濃度（采用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)計(jì)算而獲得)。

Kd值：二個(gè)或更多生物分子組成的復(fù)合物分離成組分時(shí)的平衡常數(shù) ；例如，抑制劑或底物從酶分離時(shí)的pIC50值。

pIC50值：IC 50值的10的負(fù)對(duì)數(shù)。

怎么確定做活體實(shí)驗(yàn)時(shí)需要注射多少抑制劑或者刺激物呢？ 

回答這個(gè)問(wèn)題并不容易。需要通過(guò)一些經(jīng)驗(yàn)性的預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得試劑的優(yōu)化劑量。首要考慮是這種試劑必須具備細(xì)胞穿透性。檢索報(bào)道過(guò)的IC50值，ED50值或EC50值也非常必要。以下介紹一個(gè)抑制劑用量的常用估算方法：

以H-89（一種二氫氯化物）為例。這是一種細(xì)胞穿透性蛋白激酶A抑制劑，IC50值為48nM，分子量是519.3，240-480nM可以產(chǎn)生足夠的蛋白激酶A的抑制效果?；铙w（in vivo）實(shí)驗(yàn)時(shí)我們還需要做一些估算。假定一只200g的大鼠含水量為70%，則抑制劑約在140ml中分布；這樣240nM = 240nmoles/L=124.63μg/L。抑制劑溶于140ml，即124.63×0.140 = 17.45μg，所以這只200g的大鼠需要注射的劑量為17.45ug。同時(shí)，抑制劑在體內(nèi)的實(shí)際分布與注射方式（靜脈注射，肌肉注射還是腹腔注射？）藥物利用率，半衰期，肝腎清除率，與蛋白的結(jié)合，組織特異性分布與富集等等緊密相關(guān)。特定組織或器官吸收抑制劑的量也往往比分離的細(xì)胞吸收量少。在整個(gè)活的動(dòng)物體上的研究，常常要求抑制劑達(dá)到一定的目標(biāo)濃度的負(fù)荷劑量，因此也需要通過(guò)持續(xù)給藥以保持血液中相應(yīng)的抑制劑濃度。同時(shí)，做這類(lèi)實(shí)驗(yàn)必須總是特別小心，以免在動(dòng)物上用藥過(guò)量。

抑制劑的最適溶劑是什么？ 

一般來(lái)說(shuō)，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中水常常是最佳溶劑。然而一些有機(jī)化合物難溶于水或遇水迅速降解，這時(shí)就要選用別的溶劑了。如果推薦用 DMSO作為溶劑，應(yīng)該使用沒(méi)有吸潮的新開(kāi)封的DMSO，如果有潮氣污染，很容易帶來(lái)抑制劑降解或難溶的問(wèn)題。

為什么不能直接用我的緩沖液對(duì)抑制劑DMSO母液做梯度稀釋?zhuān)?/font> 

有時(shí)這并不會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。但大多數(shù)情況下有機(jī)試劑直接加入水相介質(zhì)時(shí)容易發(fā)生沉淀而析出。較好的做法是將抑制劑先以DMSO做梯度稀釋?zhuān)賹⒔?jīng)過(guò)稀釋的抑制劑加入緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。有些抑制劑甚至只有在其工作濃度下才能溶于水相。

哪種蛋白激酶抑制劑最適合我的實(shí)驗(yàn)？ 

如果磷酸化機(jī)制尚不明了，很多抑制劑，例如Staurosporine，可以先用來(lái)確定是否有蛋白激酶參與。緊接著，一個(gè)更特異的PKA抑制劑（例如H-89產(chǎn)品編號(hào)371963或8-Br-cAMP，Rpisomer產(chǎn)品編號(hào)116816）、PKC抑制劑（例如Bisindolylmaleimide產(chǎn)品編號(hào)203290)或PKG (例如KT5823產(chǎn)品編號(hào)420321或370654)來(lái)排除多種激酶參與反應(yīng)的可能性。為了確切闡明調(diào)控機(jī)制，甚至需要選用同工酶特異性抑制劑，例如PKC就有不少這樣的抑制劑可供選擇。

怎么確定一個(gè)caspase抑制劑是可逆的還是不可逆的？ 

Caspase抑制劑的C端決定了其是可逆的或不可逆的。一般來(lái)說(shuō)，有醛基（CHO）的caspase抑制劑是可逆的。CMK，FMK和FAOM等基團(tuán)反應(yīng)性更強(qiáng)，會(huì)與酶形成共價(jià)鍵，形成不可逆連聯(lián)接。FMK較CMK反應(yīng)略弱，因此被認(rèn)為是酶抑制位點(diǎn)更特異的抑制劑。

某一特定caspase抑制劑的特異性由哪些因素決定？ 

多肽識(shí)別序列決定了 特定Caspase抑制劑的特異性。有時(shí)多肽的天冬氨酸殘基經(jīng)酯化以增加其細(xì)胞穿透性。VAD是通用的caspase抑制劑。早前VAD只是作為caspase-1 (ICE)的特異性抑制劑，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它還能抑制caspase-3和caspase-4。在這個(gè)序列上再加一個(gè)酪氨酸殘基（Y）形成YVAD，則是caspase-1的特異性抑制劑。DEVD序列識(shí)別caspase-3以及caspases-6，-7，-8和-10。

FMK型caspase抑制劑有什么優(yōu)點(diǎn)？它們與CHO型的有什么不同？ 

FMK型caspase抑制劑會(huì)對(duì)酶的硫醇基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)修飾，因此都是不可逆抑制劑。一般來(lái)說(shuō)，在這種抑制劑的氨基末端都有一個(gè)芐氧羰基（Z）,生物素或乙?；?/font>Ac）。 這些基團(tuán)都會(huì)增加抑制劑分子的疏水性，從而提高了其細(xì)胞穿透性。與帶有生物素或Ac基團(tuán)的抑制劑相比，帶有Z基團(tuán)的抑制劑的細(xì)胞穿透性更好。含生物素基團(tuán)的抑制劑常常用于標(biāo)識(shí)酶-抑制劑位點(diǎn)的檢測(cè)。CHO型抑制劑的醛基可以與caspase酶的硫醇基間可逆形成一個(gè)加合物，因此這類(lèi)抑制劑是可逆的。通常CHO型抑制劑是親水的，因此細(xì)胞吸收較慢?？赡嬉种苿┑目赡媲闆r與實(shí)際的pH值，金屬離子濃度等條件有關(guān)。當(dāng)醛基結(jié)合上天冬氨酸(D-CHO), 這個(gè)產(chǎn)物會(huì)以假酸醛形式動(dòng)態(tài)平衡。這使得這類(lèi)抑制劑有些許細(xì)胞穿透性。

選擇蛋白酶抑制劑的原則是什么？ 

在處理細(xì)胞或組織時(shí)，要考慮到細(xì)胞會(huì)向培養(yǎng)基中分泌具有活性的蛋白酶，培養(yǎng)基本身也常常帶有活性蛋白酶。因此，在樣本制備的早期步驟中加入蛋白酶抑制劑是非常必要的。為了獲得穩(wěn)定的最佳效果，建議使用前新鮮配制抑制劑。長(zhǎng)期存放在緩沖液中的抑制劑很可能失效，最好不要使用。不同的細(xì)胞或組織類(lèi)型其含有的蛋白酶情況也有所不同。絲氨酸蛋白酶在各種細(xì)胞中廣泛存在；細(xì)菌含有較多的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶；動(dòng)物組織抽提物富含絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，而植物抽提物含有更多的絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。此外，在制備IMAC（金屬螯合親和純化，例如His·Tag純化）材料時(shí)要避免使用EDTA。如果不太清楚樣本中的蛋白酶種類(lèi)，最好采用抑制劑混合物或者自行調(diào)配專(zhuān)用的抑制劑混合物。