LIF從發現、克隆到2013年已經有25年的歷史了。那么LIF是如何被發現的呢？這要從白血病的治療說起。

我們知道，正常的血液細胞是終末分化的細胞。存在于骨髓或外周血等處的微量造血干/祖細胞經過增殖和分化后可成為成熟的血液細胞，以不斷補充死去的成熟血液細胞。如果造血干/祖細胞的增殖、分化過程受到異常調節，這些細胞將停留在幼稚的細胞階段，而數目仍在不斷增加，這就是白血病的成因。因此，白血病是造血細胞的增殖和分化過程失去正常的控制而形成的。科學家一直在尋找能夠促進白血病細胞分化，同時又能抑制其增殖的細胞因子或藥物，以期治療白血病^[1]。

19世紀80年代已發現了一些調節造血細胞增殖和分化的細胞因子，如G-CSF(粒細胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)，Multi-CSF(即現在的IL-3)和IFN-γ(干擾素-γ)等。這些細胞因子的共同特點是：既能促進造血細胞的分化，又能刺激它們的增殖。這就帶來一個問題，即這些細胞因子在促進白血病細胞分化的同時，也會大量增加白血病細胞的數量，這樣可能會加重白血病的病情，而不是治療白血病。所以，科學家試圖仍然需要找到一種只誘導白血病細胞分化，但不促進白血病細胞增殖的細胞因子來治療白血病。

1969年在從SL品系小鼠的自發髓系白血病體外建系(即后來我們所熟知的小鼠M1髓系白血病細胞系，常用于重組LIF蛋白的生物活性檢測)的過程中，研究人員發現，正常細胞的培養液可誘導M1白血病細胞系分化為成熟的巨噬細胞或粒細胞。研究人員將培養液中的這些未知的誘導成分統稱為Differentiation Stimulating Factor，即分化刺激因子，簡稱D-factors (D-因子)^[2]。

1981年^[3]年和1984年^[4]科學家分別從小鼠Krebs肉瘤細胞和小鼠 L929成纖維細胞的培養液中鑒定出MGI-2(Macrophage and Granulocyte Inducing-2，巨噬細胞和粒細胞誘導-2)和一種D-因子，兩者均可誘導小鼠M1髓系白血病細胞的分化，而不刺激正常造血細胞的增殖。

緊接著在1987年，澳大利亞皇家墨爾本醫院沃爾特與伊麗莎醫學研究所(Walter and Eliza Hall Institute (WEHI), Royal Melbourne Hospital)的Donald Metcalf實驗室從小鼠Krebs肉瘤細胞培養液中分離出可以誘導小鼠M1髓系白血病細胞分化的蛋白，因該蛋白具有抑制M1髓系白血病細胞增殖的作用，因而被命名為白血病抑制因子，即Leukemia Inhibitory Factor (LIF)。同時發現，該蛋白不能刺激正常髓系前體細胞的增殖。 Donald Metcalf等認為LIF與前面所發現的MGI-2和D-因子是同一種物質，因他們最大的共同點是均可誘導小鼠M1髓系白血病細胞向巨噬細胞分化。至此，LIF蛋白被正式發現和命名，MIG-2和D-因子為其別名。隨后，Donald Metcalf實驗室分別于1987年和1988年克隆出表達小鼠LIF和人LIF的基因^[5,6]。

LIF的發現似乎給人們治療白血病帶來希望。然而深入的研究發現，LIF的作用非常廣泛，即使對于白血病細胞系，也是有些抑制，有些促進。因此，LIF與其它多功能的細胞因子，如TNF-等相似，很難應用于臨床。這些年來，LIF頗受關注。血液學家、神經生物學家、肌肉細胞生物學家、骨生物學家、內分泌生物學家和生殖生物學家都在研究LIF，可惜沒人能夠做深^[7]。LIF目前最廣泛的應用還是在實驗室里用來培養小鼠胚胎干細胞，這在后面會詳述。

LIF因為可抑制小鼠M1白血病細胞的增殖而得名，那么科學家又是如何發現其在mES培養中的重要作用呢？科研充滿了巧合，但需要敏銳和發散性的思維去感觸這種巧合。

1981年劍橋大學的Martin Evans，Matthew Kaufman和美國加州大學舊金山分校(UCSF)的Gail Martin等首先從小鼠胚胎內細胞團(Inner Cell Mass, ICM)中獲得小鼠胚胎干細胞(mES)^[8,9]的時候，必須在飼養層細胞(feeder cells)上進行培養，否則mES就會自發分化。

為分析飼養層細胞抑制mES分化的機制，人們從飼養層細胞的培養上清中分離出能夠抑制mES分化的成分^[10,11]。但這些成分的抑制分化作用均弱于英國愛丁堡大學醫學院(University of Edinburgh Medical School)的Austin Smith于1986年從Buffalo大鼠肝臟細胞培養上清中分離出來的DIA(differentiation-inhibiting activity)，即分化抑制活性蛋白^[12]。后來，Austin Smith轉到英國牛津大學工作，并繼續研究DIA。1988年與美國Genetics Institute公司合作，Austin Smith在探討DIA是否可作用于ES細胞以外的細胞時，發現DIA能夠維持DA-1a (小鼠IL-3依賴的白血病細胞系)的持續生長^[13]。湊巧的是，美國Genetics Institute公司新近剛克隆出一個能維持DA-1a細胞生長的造血生長因子基因，命名為HILDA(Human Interleukin for DA cells)。更重要的是，序列分析發現，HILDA基因與澳大利亞Donald Metcalf實驗室于同一年剛剛克隆出來的人LIF(hLIF)基因[6]序列一致，也就是說HILDA就是LIF^[14]。美國Genetics Institute公司的這兩個工作連續發表在Nature雜志1988年的同一期中。

鑒于DIA和HILDA/LIF均能夠維持DA-1a的生長，Austin Smith就在想，HILDA/LIF是否也能和DIA一樣能夠抑制mES的分化。結果是令人振奮的！即將HILDA/LIF基因克隆進入非洲綠猴COS腎細胞中進行表達，COS細胞的培養上清可抑制mES細胞的分化。而且，考慮到DIA蛋白與HILDA/LIF蛋白的分子量也相近。因此推測，DIA應該就是LIF^[13]。

上面的研究最重要的是發現了LIF可能就是能夠抑制mES分化的DIA，也揭示了LIF對不同細胞系具有不同的作用，甚至是截然相反的作用。對小鼠M1白血病細胞，LIF可促進其分化，而對于mES，LIF則抑制其分化。

估計國外科學家之間的溝通是非常多和及時的。同期，發現小鼠和人LIF的澳大利亞Donald Metcalf實驗室也敏銳地意識到DIA與LIF的相似性，并證實LIF(無論是人LIF，還是小鼠LIF)能維持mES的未分化狀態^[15]，該研究結果與美國Genetics Institute公司的兩個工作發表在1988年Nature雜志的同一期上。也就是說，Nature雜志1988年的同一期連續刊登了3篇關于LIF的文章，且都是講LIF與mES細胞培養的關系，可見LIF在mES細胞培養中的重要性。

因此在1988年底，也就是人的LIF剛剛被克隆出來的時候，人們就將目光轉向了LIF在mES培養中的作用。此后，沒人再去驗證DIA與LIF是否真為同一種物質，因只要得到了一種能夠強力抑制mES分化的因子(即LIF)就足夠了。

培養mES(小鼠胚胎干細胞)究竟是應該用mLIF(murine LIF, mLIF)，還是hLIF(human LIF, hLIF)，要從以下三個方面來考量：

第一，性能

hLIF和mLIF的發現者--澳大利亞Donald Metcalf實驗室研究證實，hLIF對小鼠M1髓系白血病細胞的誘導分化能力與mLIF相同或更好[6]，也就是說hLIF完全可以替代mLIF來培養小鼠細胞。

更重要的是，1988年Donald Metcalf在Nature上饌文專門比較了hLIF和mLIF在維持mES細胞未分化狀態的能力，發現兩者完全一致，且最適用量均為1000 units/ml^[15]。

有趣的是，hLIF可完全替代mLIF作用于小鼠細胞，但反過來，mLIF卻對人的細胞無效。這是什么原因呢？

研究表明，hLIF可與小鼠細胞上的mLIF受體(mLIF-R)結合，且親合力高于mLIF與mLIF受體的結合，這可能是hLIF對小鼠M1髓系白血病細胞的誘導分化能力比mLIF更好的原因。而mLIF不能與人細胞上的hLIF受體(hLIF-R)結合。 所以mLIF不能用于培養人的細胞^[16]。

綜上所述，hLIF和mLIF在培養mES上的性能完全相同，可以相互替代，也就是說，完全可用hLIF來培養mES。

第二，價格

hLIF和mLIF的價格相差很大，主要原因是mLIF屬于專利產品，為一家公司獨有，其價格要高出hLIF 2-3倍之多。

Donald Metcalf等發現mLIF和hLIF，以及后期有關LIF的研究工作都是在澳大利亞AMRAD公司的資助下進行的，因此在后來申請專利時，發明者(Inventors)是Donald Metcalf實驗室的人員，但受讓人(Assignee，即專利的持有者)是澳大利亞AMRAD公司。后來，AMRAD公司自己在研制LIF藥物，而將mLIF的專利權授權給另外一家公司僅用于科學研究。

從表1中可以看出，hLIF比mLIF便宜很多，且有大包裝以及無動物成分(Animal Free)的hLIF可供選擇，因此從性價比考慮，培養mES最好用hLIF。

表1：人LIF和小鼠LIF的比較

第三，與其它動物的交叉反應

我們知道，目前商品化的LIF以人和小鼠為主，其它種屬的LIF很難買到。因此，如果您除了研究小鼠的ES(胚胎干細胞)或iPS(誘導多能干細胞)，同時還研究其它動物，如牛、豬、犬、羊的ES或iPS，則不得不選用hLIF或者mLIF。

究竟是應該用hLIF，還是mLIF呢？國際上的標準是根據hLIF和mLIF與其它種屬動物LIF的同源性高低來確定。表2顯示，hLIF與牛、豬、犬、羊的LIF的氨基酸序列一致性均明顯高于mLIF，因此國際上通常用hLIF來培養這些動物的ES或iPS^[17-20]。

表2：人LIF和小鼠與其它種屬LIF的氨基酸序列一致性

總而言之，從性價比以及與其它種屬的交叉反應來考慮，用hLIF是明智的選擇。

hES(human ES，即人ES)細胞的獲得比mES晚了整整17年。 1998年，美國威斯康星大學麥迪遜分校的James Thomson和約翰·霍普金斯大學醫學院的Shamblott等首先分別從人ICM(Inner Cell Mass，內細胞團) 和PGCs (Primordial germ cells，原始生殖細胞）成功地建立了hES 細胞系^{[21, 22]}，從而開啟了對hES的科研和臨床研究。

依培養mES的經驗，在最初hES細胞的培養體系中也加入了hLIF以抑制hES的分化。但結果與預期的相悖，即hLIF無法維持hES細胞的未分化狀態。原因何在？

最初，人們推測hLIF不能抑制hES分化的原因是hES細胞表面缺乏hLIF的受體^[23]。但美國加州大學圣地亞哥分校(UCSD)的Rohan Humphrey于2004年證實hES細胞上存在hLIF的受體，且hLIF與hES上的受體結合后可以激活JAK/STAT信號傳導途徑^[24]。理論上如果JAK/STAT3信號傳導途徑被激活了，應該與hLIF或mLIF作用于mES相似，hES也應該保持未分化狀態。但結果確是，hES仍然會分化。所以該文作者認為，hES細胞的分化狀態與hLIF是否激活hES細胞的JAK/STAT3信號傳導途徑無關。

其實，不單是hES，LIF對猴(rhesus monkey)和兔(Rabbit)的ES也無效^{[25, 26]}。 問題是，什么因子可抑制這些種屬ES(包括人、猴和兔的ES)的分化呢？答案是FGF-basic，即堿性成纖維細胞生長因子，又稱FGF-2。文獻^[26-29]對FGF-basic在維持這些ES細胞未分化狀態中的作用進行了詳述。

1. mES(小鼠胚胎干細胞)的維持培養液 (有飼養層培養)

以配制500ml mES培養液為例。按下表配制，配制后，4oC可儲存2周。

注：mES對FBS的質量非常敏感，請務必使用ES細胞驗證過的FBS。

2. hES(人胚胎干細胞)的維持培養液 (有飼養層培養)

以配制500ml hES培養液為例。按下表配制，配制后，4oC可儲存2周。

3. hES(人胚胎干細胞)的維持培養液 (無飼養層培養)

為保證培養的最佳效果，最好使用商品化的hES無飼養層培養液，其優點為：

第一，含高品質的重組生長因子(FGF-basic和TGF-β1等)。

第二，極具競爭力的價格。

第三，細胞鋪板率高。

4. hLIF培養mES細胞的主要文獻

下面精選了一些用hLIF培養mES細胞的文獻，望對您有所幫助。

[1] Hozumi M. Fundamentals of chemotherapy of myeloid leukemia by induction of leukemia cell differentiation. Adv Cancer Res. 1983;38:121–169. PMID: 6192693

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轉載自：生物探索

原文鏈接：http://www.biodiscover.com/topic/technology/297.html