BD CBA原理及選用方法
BD CBA原理及選用方法
Cytometric Bead Assay（CBA），即微量樣本多重蛋白定量技術，是一個基于流式細胞檢測系統的多重蛋白定量檢測方法。它能夠同時對單個樣品中的多個指標進行檢測。日常實驗中，常需對溶液體系中的可溶性蛋白進行定量檢測，如細胞培養上清或血清血漿中的細胞因子含量的定量分析。由于這些因子的含量較少，低于一般常規方法的檢測下限，使用傳統的蛋白檢測方法很難檢測。同時由于樣本量少，一次只檢測一個因子的方法難以實現多個因子的檢測，而且費時。BD公司利用流式細胞儀對熒光信號檢測的高靈敏性，以及同時可區別多種熒光及多種熒光強度的特性，將受檢的可溶性因子附著于一些具有近似細胞直徑的微粒上，即可對受檢樣品中的多種可溶性因子進行檢測。為些，BD公司開發了微量樣本多重蛋白定量系統，簡稱CBA系統。首先利用一系列帶有熒光標記的微球連結特定的捕獲抗體以捕捉溶液系統中的待測物，然后再通過相對應的各種不同檢測物特異微球上的不同熒光強度同時定量測定分析樣本中多種可溶性成分。
BD的CBA系統的工作原理簡單，對應受檢系統中的每一個檢測指標都有不同的捕獲微球（圖1）。不同的捕獲微球上包被有特異的捕獲抗體，并具有不同的熒光強度。捕獲微球與待測樣品溶液混合后，微球上的特異性抗體首先與樣品（血清、血漿或細胞培養液）中的相應抗原或蛋白結合。然后，與加入的熒光標記的檢測抗體形成“三明治”夾心復合物，通過流式細胞儀進行熒光檢測。對樣品中的各檢測因子的含量進行分析。
圖1 BD CBA原理示意圖
BD CBA技術用于多重分析，單個樣品即可獲得更多數據。尤其是在樣品量少的情況下，多重檢測將可分析蛋白種類最大化。應用BD CBA技術，最高可分析30種蛋白，僅需25到50μl樣品。其它方法如ELISA和Western Blot用相同樣品量只能檢測一種蛋白。
BD CBA技術有兩種形式供不同需求：
一、BD CBA Flex Sets（開放、自由組合、靈活）：
BD CBA Flex Sets系統提供微球試劑的自由組合菜單，輕松實驗多重檢測，檢測指標包括人、小鼠、大鼠的細胞因子、趨化因子和生長因子等可溶性蛋白；人免疫球蛋白；磷酸化細胞信號蛋白。
特點：
——在配置有488nm或532nm和633nm激光的流式細胞應用BD CBA Flex Set系統最多可以同時檢測30種蛋白。
——每一類產品都有特定的緩沖液試劑盒（Master Buffer Kit）。所有產品均經過單個指標和多種指標的性能驗證，以確保數據的一致性。
——檢測抗體用PE直接標記，而非鏈酶親和素-PE檢測方法，PE直接檢測試劑將血清和裂解樣品中內源性生物素引起的噪音干擾減至最小。
——BD CBA細胞信號Flex Set擴展了研究才對細胞信號通路的研究。檢測涵蓋B細胞和T細胞受體信號轉導的關鍵信號分子，以及免疫反應中其他信號通路，如生長因子受體和MAP激酶信號轉導通路。
——檢測系統包括一個重組蛋白標準品作為內參，生成一條標準曲線用于定量分析。對于每一種檢測蛋白，分析軟件可以自動生成對應的Units/ml定量數值，不需要額外的步驟即可得到結果要。低CVs值，研究者對實驗結果更有信心。
操作步驟：
1、選擇人、大鼠、小鼠或細胞信號BD CBA Flex Set；
2、選擇100或500tests的BD CBA Flex Set Master Buffer Kit；
3、按照Master Buffer Kit操作指南上的說明進行操作；
4、在雙激光流式細胞儀上獲取樣品；
5、應用FCAP Array多重檢測軟件進行數據分析。
二、BD CBA Kit（常規組合，一致性結果）：
BD CBA試劑盒可以對復雜的生物學樣本在流式平臺進行多重檢測。根據生物學領域（如，Th1/Th2或炎癥細胞因子）預先固定組合，利用含有特定數量紅色染料的捕獲微球同時檢測7種蛋白。
特點：
——染料獨特的光譜特征決定了樣本可以在配置有單激光（488nm）或雙激光（488nm或532nm和633nm）的流式細胞儀上進行檢測。
——每種試劑盒包含檢測80個樣本需要的所有緩沖液和試劑。
——每一種試劑均經過嚴格的方便使用、快速數據分析，敏感性、可重復性和質量等方面的測試。
——額外的選擇，增加靈活性。BD CBA微球是未包被的微球，研究者可應用sulfo-SMCC化學試劑將自己感興趣的抗體或蛋白與之結合。包被過程只需常規實驗室用品和BD CBA功能微球結合緩沖液試劑盒中的緩沖液，不到4個小時即可完成。
三、現有CBA Kit產品：
Human Anaphylatoxin Kit C4a, C3a, C5a | Human Chemokine Kit IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10 | Human Inflammation Kit IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70 |
Human Th1/Th2/Th17 Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g,IL-17A | Human Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g | Human Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g |
Mouse Inflammation Kit IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF, IL-12p70 | Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF | Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit Heavy and light chain isotypes of IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, IgE |
Mouse Th1/Th2/Th17 Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g,IL-17A | Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-g | Human Inflammation Lyophilized Standards IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70 |
Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized Standards IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g | Mouse Inflammation Lyophilized Standards IL-6, IL-10, MCP-1, TNF, IFN-g, IL-12p70 | Mouse Th1/Th2 Cytokine Lyophilized Standards IL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF |
四、現有CBA Flex Set產品（細胞因子、炎癥因子、趨化因子）：
人 | 小鼠 | 大鼠 | |
IFN-γ,INF-α IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40 TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ IP-10 I-TAC MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β Eotaxin RANTES CD54(ICAM-1) CD62E,CD62P,CD62L CD106(VCAM-1) sCD40 sCD154(CD40 Ligand) | sCD121a,sCD121b Soluble CD14 Basic FGF VEGF Angiogenin G-CSF,GM-CSF LIF LT-α OSM Granzyme A, Granzyme B Fas Ligand(FasL) Fractalkine IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, Total IgG, | IFN- γ IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40, TNF MIG MCP-1 MIP-1 α, MIP-1 β RANTES KC CD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin) G-CSF,GM-CSF | IFN- γ IL-1 α, IL-4 , IL-6, IL-10 TNF |
五、現有CBA Flex Set產品（信號蛋白）：
Phospho Akt1(S473) | Phospho Akt2(S474) |
Phospho BLNK (Y84) | Phospho p120 Catenin(Y228) |
Phospho Btk (Y551) | Phospho MEK1/2(S222) |
Phospho eNOS (S1177) | Phospho Paxillin(Y118) |
Phospho ERK1/2 (T202/Y204) | Phospho Pyk2(Y402) |
Phospho Itk (Y511) | Phospho SLP-76(Y145) |
Phospho JNK1/2 (T183/Y185) | Phospho c-jun(S63) |
Phospho p38 (T180/Y182) | Phospho stat3 |
Phospho PLCg (Y783) | |
Phospho Rsk (T573) | |
Phospho Stat1 (Y701) | |
Phospho Syk (Y352) | |
Phospho ZAP70 (Y319) | |
Total Stat1 | Human Rex-1 Flex Set |
Total Syk | Human Oct-4 Flex Set |
Total ZAP70 | Human Nanog Flex Set |
六、產品信息：
產品名稱 | 規格 | 貨號 | 包含因子 |
Human Th1/Th2/Th17 Kit | 80次 | 560484 | IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A |
Human Chemokine Kit | 80次 | 552990 | CXCL8/IL-8, CCL5/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 |
Human Anaphylatoxin Kit | 80次 | 561418 | C4a, C3a, C5a |
Mouse Inflammation Kit | 80次 | 552364 | IL-6,IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70 |
Human Inflammatory Cytokine Kit | 80次 | 551811 | IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12 p70 |
Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit | 80次 | 557800 | IL-2,IL-4, IL-5, IL-6, TNF, IFN-γ |
Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit | 80次 | 560485 | IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10 |
Human Th1/Th2 Cytokine Kit | 80次 | 550749 | IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-γ |
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