*重要提示：在開始實驗前請查閱所用抗體的說明書中第一頁應用（APPLICATIONS）部分，確認這支抗體已經驗證過可用于你計劃采用的本實驗方法中的特定方案。

A.所需溶液和試劑

注意：用Milli-Q超純水或是相當級別的水配制溶液。

1. 10 X磷酸鹽緩沖液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化鈉 (NaCl), 2 g 氯化鉀(KCl), 14.4 g 磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氫鉀 (KH2PO4)。調整pH到7.4。
2. 甲醛溶液，16%，無甲醇的類型， Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，現配現用。開封以后放在4°C避光保存。使用時用PBS稀釋。
3. 二甲苯

無水乙醇，組織學級，100%和95%。

4. 蒸餾水(dH₂O)
5. 封閉緩沖液：配制25ml時，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（來源與二抗相同，例如正常山羊血清，正常驢血清）兌到21.25ml的蒸餾水中，混勻。邊攪拌邊加入75μL Triton X-100(100%)。
6. 抗體稀釋緩沖液  配置40ml時，取4 ml 10X PBS兌入36 ml蒸餾水，混勻。加入0.4 BSA，使溶解。邊攪拌邊加入120μL Triton X-100(100%)。
7. 10 mM 檸檬酸鈉緩沖液  配置1L時，稱取2.94g二水合檸檬酸三鈉(C₆H₅Na₃O₇?2H₂O)溶解在1L蒸餾水中。調整pH為6.0。
8. 1X PBS, 高鹽(0.4M) (高鹽PBS)：配置1L時，取100ml 10X PBS兌入900 ml蒸餾水，另加23.38 g NaCl，使溶解。
9. 熒光素標記的二抗

注意：第一次使用不論是一抗還是熒光素標記的二抗時，都需要做滴定分析以判斷何種稀釋比例能在你的樣品上得到最強的特異信號同時背景保持最低。

11. Prolong^? Gold 抗淬滅試劑(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930)

B.樣品制備

I.          細胞系培養物來源(IF-IC)

重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-IC。

注意：細胞應直接在多孔板，腔室玻片或是蓋玻片上直接培養，處理，固定和染色。

1. 用PBS稍加潤洗。
2. 吸去PBS，將細胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。

注意：甲醛有毒，需要在通風櫥中操作。

3. 室溫下固定細胞15分鐘。
4. 吸去固定劑，用PBS潤洗三次，每次五分鐘。
5. 繼續C部分的免疫染色。

II.        石蠟切片(IF-P)

重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-P。

脫蠟處理/再水化

1. 用二甲苯浸洗切片3次，每次5分鐘。
2. 用無水乙醇浸洗切片2次，每次10分鐘。
3. 用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分鐘
4. 在蒸餾水中潤濕2次，每次5分鐘。

抗原暴露：

1. 室溫下，將切片泡在10 mM檸檬酸鹽緩沖液中（pH 6.0.）。
2. 用水浴鍋或是微波爐加熱泡在檸檬酸鹽緩沖液中的玻片使之接近沸騰，保持95-99°C約10分鐘。
3. 取出玻片，放在實驗臺上自然冷卻30分鐘。
4. 在蒸餾水中潤洗3次，每次5分鐘。
5. 在PBS中潤洗5分鐘。
6. 繼續C部分的免疫染色。

III.      冰凍切片(IF-F)

重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-F。

1. 用PBS配置的2-4%甲醛溶液浸泡切片。

注意：甲醛有毒，這一步需要在通風櫥中進行。

2. 室溫下，固定15分鐘。
3. 用PBS潤洗3次，每次5分鐘。

C.免疫染色

注意：以下所有的孵育過程，除特殊說明外，需要在室溫下的避光濕盒中進行，以免切片變干和熒光淬滅。

1. 將樣品在封閉液中封閉60分鐘。
2. 封閉結束前，按說明書的指示用抗體稀釋緩沖液稀釋一抗。
3. 吸去封閉液，加入稀釋的一抗。

.注意：在做雙染時，將兩種抗體按各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。

4. 在4°C孵育過夜。
5. 用PBS潤洗3次，每次5分鐘。

可選：為降低背景，在第2次PBS潤洗和第3次BS潤洗之間可增加高鹽PBS潤洗2分鐘的步驟。但也要注意，這一步可能會降低一些抗體的特異信號。

注意：如果所用一抗直接標記有Alexa Fluor^?熒光素，則直接跳到C8步。

6. 把熒光素標記的二抗稀釋在抗體稀釋液中的，將樣品與稀釋抗體在室溫下避光孵育1-2小時。

注意：在做雙染時，將兩種二抗體各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。

7. 按第5步用PBS/高鹽PBS潤洗切片。
8. 涂上Prolong^? Gold抗淬滅試劑后蓋上玻片。處理多孔板時，抗淬滅試劑蓋住細胞細胞即可。
9. 在蓋玻片的周圍涂上指甲油密封。
10. 立即在顯微鏡下用相應波長激發光觀察樣品可以得到最佳的效果。如果要長期保存，將玻片放在4°C避光保存。

推薦的二抗

抗兔：

• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^? 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^? 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^? 647 Conjugate) #4414
• Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (DyLight? 488 Conjugate) #4315

Anti-Mouse

抗小鼠

• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^? 488 Conjugate) #4408
• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^? 555 Conjugate) #4409
• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^? 647 Conjugate) #4410
• Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')₂ Fragment (DyLight? 488 Conjugate) #4316

Anti-Rat

抗大鼠

• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^? 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^? 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^? 647 Conjugate) #4418

轉載自www.cst-c.com.cn