ChIP技術(shù)總結(jié)

（一）、關于細胞

細胞的生長狀態(tài)直接影響細胞內(nèi)部的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡，也很有可能影響所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。一般細胞長到75％－80％比較好。

 

（二）、關于交聯(lián)

甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復合體，防止細胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應是完全可逆的，便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據(jù)實驗而定。值得注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，增加背景，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被甘氨酸終止。交聯(lián)條件和細胞類型也有一定關聯(lián)。不同的細胞系，交聯(lián)的條件也不一樣。例如：NIH－3T3的交聯(lián)條件是室溫（25℃）15min，1％的甲醛濃度，而別的細胞系則可能完全不一樣。

 

（三）、關于超聲破碎

超聲破碎的條件，機器不一樣，條件也不一樣。一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質(zhì)變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫?？偝晻r間也不要太長，以免蛋白降解。

Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease處理的ChIP試劑盒（EZ-Enzyme），與超聲波處理相比，Micrococcal Nuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個核小體，結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA-蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品及組蛋白研究。

 

（四）、關于Beads

利用目的蛋白的特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO₃洗脫免疫沉淀復合物。

Magna beads使用起來方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，操作過程更簡單，而且免去了離心，節(jié)省不少時間，一天就可以完成ChIP實驗，適合高通量實驗。

CST提供ChIP級別的Protein G Agarose beads（目錄號：9007）和Protein G Magna beads（目錄號：9006），其中，Protein G Magna beads需配合磁力架一起使用（目錄號：7017）。 

另外，Merck Millipore公司也有多種ChIP級別Magna beads（目錄號：16-662、16-663X）以及相應磁力架（目錄號：20-400）。

 

（五）、關于抗體

   抗體是實驗成敗的致命因素之一！單抗與多抗各有利弊。單抗特異性強，背景低，但是識別位點單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有這個問題，但是多抗特異性較差，背景可能會偏高。所以，應盡可能的選擇高品質(zhì)抗體。比如Abcam、CST、Millipore、BD等多家公司都提供ChIP級別的抗體，經(jīng)過嚴格的實驗室檢測，確保效率及實驗結(jié)果的可靠性，推薦使用。

 

（六）、關于解交聯(lián)和DNA片段的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質(zhì)量高，有利于下一步PCR等方法的檢測。甲醛不僅交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)，還交聯(lián)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，所以還可以對DNA序列上的蛋白質(zhì)復合物進行分析。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質(zhì)，進行分析。

Merck Millipore現(xiàn)推出ChIP Ab+抗體引物套裝，性價比高，包括：陰性對照抗體，保障ChIP反應的特異性；qPCR對照引物，用于檢驗ChIP結(jié)果。CST也有多種ChIP抗體和引物組合，供您選擇。

小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

 

（七）、陽性與陰性對照

在做ChIP實驗時，一定要做好實驗對照，沒有對照，很難對實驗結(jié)果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是最基本的實驗對照，陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA PolymeraseII 抗體等；陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA 的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會選擇數(shù)對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結(jié)合的DNA 序列，作為該抗體的陰性對照。

 

（八）Input對照

在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。

目前，許多公司都提供ChIP完整的配套試劑盒，為您的實驗提供很多便利。推薦幾家，比如Merck Millipore公司的EZ-ChIP試劑盒及Magna-ChIP試劑盒（17-610、17-611）。其中EZ-ChIP試劑盒（目錄號：17-408、17-409）不僅提供普通ChIP試驗所需的試劑（甲醛溶液，無機鹽緩沖液除外），還提供陰性抗體、陽性抗體對照及DNA純化柱，使您的試驗更為可靠、高效。注：該試劑盒不含抗體，需要用戶自行選擇ChIP級抗體。

另外，CST公司也相繼推出幾款ChIP試劑盒，如The SimpleChIP? Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads 目錄號：9002、Magnetic Beads目錄號：9003）和SimpleChIP? ChIP Kits 是由 CST 和 NEB 共同研發(fā)，基于酶解的新一代染色質(zhì)免疫沉淀檢測試劑盒。該試劑盒包含ChIP驗證的抗體和ChIP級別的Protein G瓊脂糖珠/磁珠，其中的DNA純化柱可以直接高效回收DNA、去除蛋白，而免去苯/氯仿抽提和乙醇沉淀。