免疫組化關鍵環節剖析

1、酶免疫組化的關鍵環節

1）標本固定：固定的目的是①防止標本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③固定的標本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛。

2）脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。

3）脫蠟和水化：為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應，需對切片進行脫蠟。脫蠟可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min（這個時間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當天制好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全，易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。

4）抗原修復：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。其中，徠卡（Leica）的Novocastra^TM抗原修復液（code:AR9640、AR9961）適用于對福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片進行熱引導的抗原修復(HIER) ，不同的HIER方式結合不同PH值的抗原修復液，得到最好的抗原暴露效果。

5）細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。在免疫組織化學（>10um厚切片） 和免疫細胞化學中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。同時也是一種去污劑，一般在PBS中加入后終濃度是0.05%即可，而前者終濃度是0.5%-1%。石蠟切片4um左右可以不通透，因為細胞已經被切開了。

6）滅活內源性過氧化物酶和生物素：在傳統的ABC法和SP法中，免疫組化反應結果容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活。滅活內源性POD，3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右，而0.3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10-30min。

7）血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續結果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫10-30min，也要防止封閉過度。

8）一抗和二抗濃度和孵育時間：一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳，但時間最好超過16~24h；孵育時間與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min，具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。

9）抗體稀釋液：其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。比如BD公司的即用型抗體稀釋液（code：559148），適用于丙酮固定、甲醛固定、石蠟切片、冰凍切片等各種組織、細胞類型。徠卡Novocastra^TM的抗體稀釋液（code：RE7133）用于稀釋免疫組化中的一抗、生物素標記的二抗等；而Bond?一抗稀釋液（code：AR9352）專門用于BOND?系統的個人化一抗。除此之外，Merck Millipore也有用于石蠟切片免疫組化的抗體稀釋液（code：21544）。

值得一提的是，徠卡Novocastra^TM的一抗種類繁多，可以直接使用，不需要摸索最佳稀釋度，消除了稀釋誤差，提高可重復性。另外，Merck Millipore、BD、CST也提供多種類型、高品質的抗體。

10）切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，一般在一抗孵育前清洗3min*3次，一抗孵育后清洗5次*5min。

注意：①單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落。③沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。④PBS的PH在7.4-7.6，濃度0.01M左右。中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）

11）DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，顯微鏡下控制顯色時間，出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗。DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜），另一方面就是封閉時間過長。

12）復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，常用蘇木素復染（胞核染料）。注意蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘，胞漿蛋白可以適當時間長一點，而胞核蛋白則要短。徠卡Leica的蘇木精（code：RE7107）25ml僅需26.5元，實惠的同時還保證復染效果，不妨一試。Merck Miliipore也提供各種規格的蘇木精（code：1043020025、1043020100、1043021000），供您選擇。

染色不理想的補救方法：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭，作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

13）封片：為了長期保存，一般用中性樹膠等封片。可直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

 

2、免疫熒光方法中的重要環節

1）冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。

2）組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

3）血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。

4）一抗孵育條件：在免疫組化反應中，孵育時間和抗體濃度最重要。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min，具體條件需要摸索。

5）二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。

6）復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。Merck Miliipore有一款即用型DAPI（code：S7113），其中DAPI是溶解在Antifade中，Antifade可以防止熒光信號過快地淬滅，從而得到較好的染色效果。

7）封片：為了長期保存，一般用緩沖甘油等封片。目前市場上多家公司都提供專門的抗熒光萃滅封片液，封閉效果很好。

8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，一般在一抗孵育前清洗3min*3次，一抗孵育后的清洗均為5次*5min。

注意：

（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。

（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。

（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。

（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求：建議PH在7.4-7.6，濃度0.01M。中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。

（5）拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1-2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3-5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象，所以最多不得超過2-3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。