免疫組化常見問題及解決方案

 

一、非特異性染色

1.      內源性酶和生物素有殘留。對于內源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，才需考慮此原因。

（1）    滅活堿性磷酸酶的常用方法是將左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2。對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

（2）    消除內源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內源性生物素，使之不再有剩余的結合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸于25ug/ml親和素溶液中處理15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。徠卡（Leica）提供專門的抗生物素/生物素封閉系統（code：RE7107），可以很好地消除內源性生物素引起的高背景。

2.      封閉劑使用不當。

可以用二抗動物的非免疫血清孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關蛋白，如牛血清白蛋白也常應用。另外，取材時避開出血、壞死區也極其重要。封閉劑的選擇也很重要，不妨試試Merck Millipore IHC專用的封閉劑（code：20773），搭配IHC Select? 檢測試劑，效果更好。徠卡（Leica）也有相應的封閉劑，可用于IHC、ISH的封閉環節。

3.      所選擇的抗體不符合實驗要求。

因抗原不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。許多公司，比如BD、Merck Millipore、CST等都提供多種類型的抗體，用于免疫組化。其中，徠卡Novocastra^TM的一抗種類繁多，可以直接使用，不需要摸索最佳稀釋度，

4.      一抗濃度過高。這種情況應該適當稀釋抗體。

5.      標本染色過程中干涸。

組織變干會造成邊緣部分的非特異性染色。修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

6.      DAB變質、顯色時間太長。

DAB的孵育時間和配制方式可以產生某些背景顏色。DAB最好現用現配，如有沉渣應過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。其中Merck Millipore（code：281753-50ML）、Leica的DAB顯色劑使用方便，顯色效果穩定，可用于細胞或組織在免疫組化或原位雜交時結合的辣根過氧化物酶顯色，或者Western等結合有辣根過氧化物酶的膜的顯色檢測。另外，Leica提供DAB片劑(code：DAB-K)，一片DAB可配制成10ml的工作液，存放時間長、性價比高。

 

二、染色過強

1.    抗體濃度過高或抗體孵育時間過長

稀釋抗體，減少抗體孵育時間。

 

2.    孵育溫度過高

一般室溫20-28℃即可。

 

3.    DAB顯色時間過長或DAB濃度過高

嚴格按照說明配制DAB，顯色時間控制在5-10分鐘左右。

 

三、染色弱

1.    抗原修復不徹底。

石蠟切片在制作過程中固定劑會封閉抗原，所以封閉之前必須修復抗原，暴露抗原決定簇，以便與抗體結合。否則，樣本抗原中可以與抗體結合的位點變少，導致最后相應的顯色呈弱陽性。徠卡（Leica）專利的抗原修復試劑可以很好的完成這一環節，最大限度的修復封閉抗原。

 

2.    抗體的稀釋度過高

應參照抗體廠家的使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。

 

3.    孵育的溫度過低、孵育時間過短。

一般室溫20-28℃即可。可以選擇37℃孵育30-60分鐘或者4℃冰箱過夜。

 

4.    封閉時間過長。

封閉時間過長，抗原中本應該與一抗結合的位點也被封閉掉，導致一抗的結合量減少，最終染色很淡。封閉時間最好不要超過10分鐘。