Western Blot 常見問題及解決方案

 

大家都知道，Western Blot分為四個基本的步驟：樣品制備—電泳—印跡—免疫檢測。要想成功的完成Western Blot實驗，每一步都很重要。

我們對Western Blot常見問題進行歸類，總結出了以下幾類。

下面一一闡述，首先來看Western Blot遇到的第一個問題——樣品制備。

一、樣品的常見問題

1.       如果目標蛋白是膜蛋白或胞漿蛋白，操作需注意什么？

解答：如果目標蛋白是膜蛋白或胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多。目前市面上有專門針對亞細胞組分的蛋白抽提試劑盒，可以高效的富集到活性蛋白。如默克密理博開發(fā)的相應的亞細胞組分抽提試劑盒。包括胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白以及細胞骨架蛋白。提取過程中不需要超高速離心及高溫孵育，以較少起始材料就能獲得足夠量的高品質蛋白，以滿足下游實驗。

2.       處理組織樣品有什么注意事項？

解答：組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性。許多公司，如默克密理博等都提供有蛋白酶抑制劑。

二、電泳轉移的常見問題

1.       大分子量蛋白的轉移效率低？

解答：（1）優(yōu)化轉移緩沖液；（2）轉移緩沖液中加入20%甲醇，甲醇可以降低蛋白的洗脫效率，增加蛋白和膜的結合能力。（3）轉移緩沖液中加入終濃度0.1% SDS。（4）提高轉移電壓/電流，增加轉移時間。（4）選擇優(yōu)質的轉移膜。默克密理博提供各種孔徑大小的膜，蛋白吸附能力強，結合穩(wěn)固，信號更強，不妨一試。

2.       膜、濾紙、膠大小有何講究？

解答：濾紙的長寬分別比膠小1—2mm，而膜的長寬分別比膠大1—2mm。絕對禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會導致短路。

三、檢測結果中常見的問題

1.       背景過高？

解答：背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉移緩沖液或設備有污染、抗體稀釋度不對或抗體不純。

（1）       封閉不完全

一抗或二抗只要結合到膜上，就會顯色。為了避免非特異性的結合，應用封閉液孵育膜，使所有的空白位點都被封閉蛋白占有。NC膜推薦封閉液是3%的明膠，室溫孵育1小時。如果想要低溫封閉的話，可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。

傳統(tǒng)的牛奶/蛋白類封閉劑會形成較厚的、粘粘的蛋白層，導致與抗體發(fā)生非特異性相互作用，增加背景；另一方面，牛奶中本身含有的磷酸化蛋白會干擾蛋白磷酸化檢測。Merck Millipore的BlФk?-CH封閉劑（目錄號：WBAVDCH01）是一種無蛋白化學試劑，不會像牛奶一樣在膜表面形成厚而粘稠的一層，可以顯著降低背景，改善蛋白檢測效果；而且性質非常穩(wěn)定，室溫可存放兩年以上；洗去雜交信號后，可繼續(xù)考染保存數據，不必額外跑一次電泳。

（2）       顯色過度

顯色時間的長短取決于蛋白條帶的數目以及你想要的靈敏度。如果膜在顯色液中放置太久，背景就會偏高。應當在蛋白條帶清晰可見，而背景幾乎沒有或很少時，將膜及時取出。

（3）       洗滌不充分

在封閉以及抗體孵育之后，至少要洗兩次膜，每次5分鐘。去污劑的濃度不要太高，否則會把抗原從膜上洗下來。

（4）       轉移緩沖液或設備污染

使用清潔劑將轉印槽內外徹底清洗干凈，海綿墊也一定要認真清洗，臟的海綿墊通常是污染的最主要原因。另外，每次轉膜時的緩沖液都要是新鮮配制的。

（5）       抗體稀釋度不正確

一抗的稀釋度應根據抗體來源和經驗來決定。一般來說，以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清?？贵w稀釋度不夠，會產生非特異的結合，帶來高背景。重點推薦Merck Millipore的SignalBoost?免疫信號增強劑(目錄號：407207-1KIT)，SignalBoost?作為抗體稀釋液，在一抗、二抗孵育時增加了抗體與其反應表位的專一親和力，從而增強信號強度。SignalBoost?與化學發(fā)光、熒光、顯色等各種檢測方法兼容。最重要的，使用SignalBoost?可以節(jié)省寶貴的抗體，僅需要常規(guī)western blot中抗體用量的10%即可獲得同樣強度的信號。

（6）       二抗不純

沒有交叉吸附過的二抗可能會與膜上的其他蛋白相互作用，產生雜帶。這種情況可以選用單克隆的二抗。BD、Merck Millipore等都提供多種類型的高品質二抗。

2.       信號較弱？

解答：雜交信號弱也是由多方面因素造成的：

（1）       封閉劑不合適

封閉劑可能與目的蛋白有親和性而干擾了檢測。換用其他封閉劑或減少封閉劑的用量及孵育時間。

（2）       抗體失活或抗體濃度太低

抗體長期保存應在—70℃，使用前最好做效價檢測；增加抗體濃度。

（3）       抗原不充足

抗原不充足也就是目的蛋白的量不夠，應該適當增加蛋白的上樣量，并且做已知標準量蛋白的對照。

（4）       膜漂洗過度

減少漂洗的時間和次數。

（5）       蛋白轉移有問題

蛋白轉移不充分，導致膜上的蛋白量很低，減弱了檢測效果。應該優(yōu)化蛋白轉移操作過程，選用高品質的轉印膜。

3.       出現非特異性條帶？

（1）       一抗的特異性低/一抗?jié)舛冗^高

重新選擇一抗，盡量使用大品牌、高品質的單克隆一抗。推薦BD、Merck Millipore公司的一抗；增加一抗的稀釋度。

（2）       二抗?jié)舛冗^高/二抗出現非特異結合

增加二抗的稀釋度；選擇特異性強的二抗。

（3） 抗原量過高——減少蛋白上樣量。