Western Blot 樣品制備全攻略

 

樣品制備是Western Blot的第一步，直接關(guān)系到所得目的蛋白的純度和濃度，主要有以下兩種方法：

（1）通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白

a.水溶液提取法：針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。

b.有機溶劑提取法：對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。

（2）通過層析或電洗脫法制備目的蛋白。

 

下面我們看看樣的品制備的分類及需要注意的一些事項：

 

1. 不同來源樣本的蛋白制備方法

（1）體液樣品，如血清、血漿等

對于檢測體液中的低豐度蛋白，有效的降低樣品中蛋白組分的復雜性是關(guān)鍵，而高豐度蛋白（白蛋白和IgG）的去除是一大問題。一般方法很難從體液中高效、特異性去除白蛋白和IgG，白蛋白和IgG的殘留直接影響下游目的蛋白的檢測，造成假陽性。

默克密理博的ProteoExtract高豐度蛋白去除試劑盒（目錄號：LSKMAGD12、LSKMAGD12-1）可以做到！另外，新推出的PureProteome磁珠版產(chǎn)品(目錄號：LSKMAGL10)更是方便了小量樣本的操作。

（2）原核細胞的蛋白抽提

以大腸桿菌為例，大腸桿菌一般采用超聲破碎的方法。但是超聲破碎有很多不足之處，超聲破碎是一種很強的機械力，損傷蛋白的活性是一方面；破碎過程中產(chǎn)生的大量熱量也會使目的蛋白降解。

默克密理博Novagen推出了Buster系列優(yōu)化去污劑及其它成分的裂解抽提試劑，其中BugBuster(目錄號：71456-3、70584-3)用于大腸桿菌蛋白抽提。這種新型抽提試劑能非常溫和、高效地從目的細胞中制備可溶蛋白。

（3）酵母、植物細胞的蛋白抽提

你還在拿著研磨棒，邊加液氮邊吃力地研磨嗎？既不方便，又嚴重的損傷蛋白，事半功倍！試試默克密理博的YeastBuster（目錄號：71186-3），一步法抽提，保證蛋白活性的前提下，又方便了下游的純化和分析。

（4）昆蟲/哺乳動物細胞的蛋白抽提

超聲、凍融等一系列激烈的細胞處理，步驟繁瑣又損傷蛋白活性，間接降低有效蛋白的提取量。而默克密理博的CytoBuster（目錄號：71009-3）中溫和的非離子成分能夠分離功能活性的內(nèi)源或表達蛋白。

（5）亞細胞蛋白組分的抽提

亞細胞蛋白組分的抽提相對來說比較復雜，傳統(tǒng)的方法既麻煩又耗時，關(guān)鍵在于很難高效富集到活性蛋白。針對不同的細胞器，默克密理博開發(fā)了相應的亞細胞組分抽提試劑盒（目錄號：539790-1KIT、71771-3）。包括胞漿蛋白、膜蛋白（目錄號：71772-3、444810-1KIT）、核蛋白（目錄號：2900、71183-3）以及細胞骨架蛋白（目錄號：17-10195、17-10210）。提取過程中不需要超高速離心及高溫孵育，以較少起始材料就能獲得足夠量的高品質(zhì)蛋白，以滿足下游實驗。

2.核酸的去除

樣本中若殘留核酸，往往會對蛋白研究產(chǎn)生干擾，所以應該盡量將核酸去除干凈。一般的方法很難把所有形式的DNA和RNA（單鏈、雙鏈、線形和環(huán)狀）去除，而且去除過程中增加了樣品的粘度，直接影響下游實驗。針對這類問題，默克密理博推出了Benzonase核酸酶（目錄號：70664-3、70746-3、71205-3、71206-3），這種全能酶可以降解所有形式的核酸，迅速降低樣本粘度，增加蛋白產(chǎn)量。

3.蛋白酶的抑制

內(nèi)源性和外源性的蛋白酶可以在細胞或組織裂解后迅速降解蛋白。而蛋白的水解降低了蛋白的量和活性。為了避免蛋白水解，通常會加入蛋白酶抑制劑，但是仍然不能起到徹底的抑制效果。默克密理博的蛋白酶抑制劑（目錄號：539134-1ML、539134-1SET）是一種混合物，可以全面、穩(wěn)定的抑制各種蛋白酶的活性使單邊樣品保持完整，保證下游蛋白分析和復雜蛋白研究。

4.磷酸酶的抑制

在磷酸化蛋白的提取過程中，內(nèi)源性的蛋白磷酸酶會去除磷酸基團，使蛋白恢復到去磷酸化狀態(tài)。為了保持目的蛋白的磷酸化狀態(tài)，必須抑制蛋白磷酸酶的活性。默克密理博的磷酸酶抑制劑混合物（目錄號：524625-1SET、524629-1ML、524629-1SET）可以全面、穩(wěn)定的達到這種抑制效果。另外，PhosphoSafe磷酸化蛋白專用試劑盒也非常有效。

5.免疫沉淀

純化天然構(gòu)象的蛋白或變性蛋白，免疫沉淀是很好的選擇。但常規(guī)的免疫沉淀又存在許多問題，比如操作時間很長，過程很繁瑣，最后純化的效果也不一定很好。這時，您可以試試默克密理博的Catch and Release可逆免疫沉淀試劑盒(目錄號：17-500、17-500A、17-501、17-502)，最短30分鐘可以完成IP的孵育過程，非?？焖?，而且采用了特別的抗體捕獲親和配體（ACAL），大大降低了非特異性結(jié)合。

6.重組表達蛋白的純化

為了特異地從復雜背景中分離目的分子，或者制備蛋白用于相互作用分析，或者從某個反應中去除某種分子等，親和純化技術(shù)是個不錯的選擇。

目前包括BD在內(nèi)的許多公司都提供有商品化的純化試劑盒。BD公司可提供用于帶有6×His、GST融合標簽的重組蛋白的純化試劑盒，省時省力。默克密理博的產(chǎn)品種類更全，包括用于大腸桿菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞表達的帶有His、GST、S、Strep、HSV、Nus、T7等各種融合標簽的重組蛋白的純化和分析產(chǎn)品（目錄號：70239-3、70541-3）。每一種融合純化和檢測，Novagen都提供多種產(chǎn)品和試劑盒形式，毫升級到升級、單個樣本或高通量，總有一款默克密理博純化產(chǎn)品適合你！

7.樣品超濾濃縮

在蛋白樣品的制備過程中，往往含有高鹽及其他小離子成分，而且蛋白是被稀釋的，需要對所得蛋白樣品進行濃縮和去鹽。超濾是不錯的選擇，所以多種多樣的超濾管問市。在眾多公司中，默克密理博的Amicon Ultra超濾管（目錄號：UFC905096(常用規(guī)格)）一直以其優(yōu)良的質(zhì)量和不斷的創(chuàng)新，成為行業(yè)標桿。Amicon Ultra的4種超濾管可以濃縮4種不同大小的蛋白。Amicon Ultra設(shè)計靈巧，死體積設(shè)計可以防止過度離心而導致樣本過干；反轉(zhuǎn)離心回收設(shè)計保證了最大的回收率；垂直結(jié)構(gòu)的豎膜設(shè)計避免堵膜，在短時間內(nèi)即可完成濃縮、去鹽和換緩沖液；并且化學兼容性寬泛，樣品絕不會滲漏，是您不錯的選擇！

8.樣品透析

    制備的蛋白樣品中含有小分子物質(zhì)。這些小分子物質(zhì)（無機鹽、糖等）可以自由通過透析膜與周圍的緩沖溶液進行溶質(zhì)交換，進入到透析液中。而蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，它不能透過透析膜，所以就與小分子物質(zhì)分離開來。傳統(tǒng)的透析方法是采用透析袋，這種方法耗時長，甚至過夜，而且透析不徹底?，F(xiàn)在來試試默克密理博的D-tube透析管和電洗脫管，操作起來更方便，減少了樣品污染和損失，2-5小時完成透析，效率大大提高。